Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
نهج لدراسة النسخ المعتمدة على الشكل على مستوى خلية واحدة
Chapters
Summary November 2nd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
تعرض هذه الورقة طرقًا لنمو الخلايا القلبية ذات الأشكال المختلفة ، والتي تمثل أمراضًا مختلفة ، وفرز هذه الخلايا القلبية المؤمنة استنادًا إلى مورفولوجياها على مستوى خلية واحدة. توفر المنصة المقترحة نهجًا جديدًا في الإنتاجية العالية وفحص الأدوية لأنواع مختلفة من قصور القلب.
Transcript
نقترح منصة جديدة للتحقيق في آثار شكل الخلية على التعبير الجيني، وذلك باستخدام أساليب لزراعة وفرز التمسكات مع morphologies مختلفة على مستوى الخلية الواحدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسهل دراسة عالية الإنتاجية من شكل الخلية في المختبر كما مقارنة الخلايا مع أشكال مختلفة في الجسم الحي يتطلب من الناحية الفنية. لإعداد ثقافة cardiomyocyte منقوشة، نقل تعليق cardiomyocyte في نسبة العرض إلى الارتفاع من الفائدة إلى أنبوب 15 ملليلتر لحساب وتمييع الخلايا إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخمس لكل ملليلتر من التركيز المتوسط الطلاء المناسب.
إضافة ملليلترين من الخلايا على رقاقة micropatterned المغلفة الليفية المغمورة في مليلترين من المتوسطة الطلاء الدافئ داخل طبق 35 ملليلتر غرينييه بيتري ووضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 18 ساعة. في اليوم التالي، تحقق من الشريحة عن طريق المجهر الخفيف للتأكد من أن معظم الخلايا قد تعلق. إزالة المتوسطة من الطبق لإزالة أي حطام وخلايا ميتة، وبدءا من المركز والتحرك نحو الجانبين بطريقة قطرة الحكمة، بلطف إضافة برنامج تلفزيوني إلى الخلايا.
بعد الغسيل الثالث، استبدل برنامج تلفزيوني بـ 4 ملليلتر من متوسط الصيانة وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية. بعد 72 ساعة، تدفق بلطف سطح رقاقة مرتين مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني دافئ Dulbecco في غسل كما هو موضح واستخدام ملقط لنقل على الفور رقاقة غسلها إلى طبق جديد معقمة 35 ملليلتر غرينييه بيتري. إضافة بسرعة 1.5 ميكرولترات من ثنائية خضراء نابضة بالحياة المخفف 1000 أضعاف في DPBS إلى الشريحة.
إصلاح غرفة على رقاقة ووضع الطبق على حامل طبق من مرحلة منتقي الخلية. أدخل الغطاء المغناطيسي وحدد موقع التقاطع في نافذة المنظر المباشر. التركيز على التقاطع، وفي إطار المسح الضوئي والفرز، حدد المعايرة للحقن التلقائي ومعايرة.
استبدل الطبق المكبر بـ 1.5 ملليلتر من E ثلاثية واحدة في حل DPBS لتخفيف الخلايا من الليفية وفتح علامة التبويب المسح الضوئي. لمسح رقاقة كاملة، والتركيز على الزاوية اليسرى العليا من رقاقة في مجال الرؤية وانقر فوق الحصول على موقف المجهر الحالي. المقبل، والتركيز على أسفل الزاوية اليمنى من رقاقة وانقر فوق الحصول على موقف المجهر الحالي.
في النافذة المنبثقة، انقر فوق تعيين الطائرة الأكثر حدة وانقر على الانتقال إلى أعلى اليمين والذهاب إلى أسفل أزرار الزاوية اليسرى. ثم انقر فوق إنهاء لبدء المسح الضوئي. عند اكتمال المسح الضوئي، افتح علامة التبويب التحليل وانقر فوق إظهار الخريطة لتحديد الخلايا المفردة التي تجتاز معايير الدراسة.
مركز الزجاج microcapillary في منتصف المجهر عرض العيش وفتح التبويب مضخة. لخلق فراغ، تراجع المكبس من 50 ملليلتر عدد حقنة واحدة أربعة ملليلتر وفتح علامة التبويب الفرز. للسماح بانتقاء خلية واحدة، قم بتعيين الصمامين لفتحهما لمدة 120 مللي ثانية، وفتح صمام واحد لمدة 20 مللي ثانية بعد مرور 200 مللي ثانية.
للسماح بتسليم الخلية التي تم اختيارها بنجاح إلى أنبوب PCR الذي يحتوي على عازلة تحلل، تعيين صمام واحد ليتم فتحه لمدة 20 مللي ثانية والصمام الثاني ليتم فتحه لمدة 10 مللي ثانية بعد مرور فترة زمنية من 10 مللي ثانية. عند ضبط إعدادات الصمام، انقر فوق حساب المسار. البرنامج سوف يحسب أسرع مسار من خلية إلى خلية لالتقاط وحقن الخلايا المحددة في جميع أنحاء رقاقة.
ثم، ركز المجهر على نمط على سطح الشريحة. استخدام عصا التحكم لتحريك microcapillary إلى أسفل بعناية بحيث يمكن الحصول على صورة حادة من غيض من microcapillary دون لمس سطح رقاقة وانقر فوق مجموعة. سيتم فتح نافذة جديدة، تظهر المقطع العرضي للكابيلات الصغيرة.
لجعل البرنامج يسجل إزاحة تلميح من الشعرية في X و ص و Z الإحداثيات، انقر على مركز الدقيق من الشعرية. ثم انقر فوق بدء الفرز لبدء الفرز. في هذا التحليل التمثيلي لـ cDNA المُكبرة مسبقًا من خلية مفردة منتقى ، لوحظ وجود نطاق واضح في مؤامرة قياس الكثافة مثل الجل المقابل للذروة عند 1 ، 852 زوجًا أساسيًا في المخطط الكهربائي.
كان متوسط حجم الأجزاء 1, 588 أزواج قاعدة مع عدد صغير من الأجزاء التي كانت أقصر من أزواج قاعدة 300, تشير إلى إنشاء مكتبة cDNA جيدة. يمكن أيضًا إجراء التلطيخ والتحليل المناعي لتقييم بنية السارومور داخل الخلايا القلبية المنقوشة. هذه المنصة تمهد الطريق لدراسة عالية الإنتاجية وفحص المخدرات من أنواع مختلفة من فشل القلب.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
