Genetics
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Une approche pour étudier la transcriptomics dépendante de la forme à un seul niveau cellulaire
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Summary November 2nd, 2020
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Cet article présente des méthodes pour la croissance des myocytes cardiaques de différentes formes, qui représentent différentes pathologies, et le tri de ces myocytes cardiaques adhérents basés sur leur morphologie à un seul niveau cellulaire. La plate-forme proposée offre une nouvelle approche au débit élevé et au dépistage des médicaments pour différents types d’insuffisance cardiaque.
Transcript
Nous proposons une nouvelle plate-forme pour étudier les effets de la forme cellulaire sur l’expression des gènes, en utilisant des méthodes de croissance et de tri des adhérences avec différentes morphologies au niveau d’une seule cellule. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite l’étude à haut débit de la forme cellulaire in vitro car la comparaison des cellules avec différentes formes in vivo est techniquement exigeante. Pour mettre en place une culture cardiomyocyte à motifs, transférez une suspension cardiomyocyte au rapport d’aspect d’intérêt à un tube de 15 millilitres pour compter et diluer les cellules à une fois 10 aux cinq cellules par millilitre de concentration moyenne appropriée de placage.
Ajouter deux millilitres de cellules sur une puce micropatrifiée recouverte de fibronectine immergée dans deux millilitres de milieu de placage chaud à l’intérieur d’une boîte Grenier Petri de 35 millilitres et placer le plat dans un incubateur de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 18 heures. Le lendemain, vérifiez la puce par microscopie légère pour confirmer que la plupart des cellules se sont attachées. Retirez le milieu du plat pour enlever les débris et les cellules mortes, et à partir du centre et en se déplaçant vers les côtés d’une manière goutte-sage, ajouter doucement PBS aux cellules.
Après le troisième lavage, remplacer le PBS par un milieu d’entretien de quatre millilitres et retourner les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire. Après 72 heures, rincer doucement la surface de la puce deux fois avec deux millilitres de PBS chaud de Dulbecco par lavage comme démontré et utiliser des forceps pour transférer immédiatement la puce lavée dans une nouvelle boîte stérile grenier Petri de 35 millilitres. Ajoutez rapidement 1,5 microlitres de vert dicycle dynamique dilué 1000 fois en DPBS à la puce.
Fixer une chambre au-dessus de la puce et placer le plat sur le porte-vaisselle de l’étape du cueilleur de cellules. Insérez le capuchon magnétique et localisez le réticule dans la fenêtre de vue en direct. Concentrez-vous sur le réticule et, dans la fenêtre de balayage et de tri, sélectionnez l’étalonnage pour l’injection automatisée et le calibre.
Remplacez le plat supernatant par 1,5 millilitres d’un triple E en DPBS pour desserrer les cellules de la fibronectine et ouvrir l’onglet de balayage. Pour scanner l’ensemble de la puce, concentrez-vous sur le coin supérieur gauche de la puce dans le champ de vision et cliquez sur obtenir la position actuelle du microscope. Ensuite, concentrez-vous sur le coin inférieur droit de la puce et cliquez sur obtenir la position du microscope actuel.
Dans la fenêtre popup, cliquez sur définir le plan le plus pointu et cliquez sur aller en haut à droite et aller vers les boutons du coin inférieur gauche. Ensuite, cliquez sur la finition pour commencer la numérisation. Lorsque la numérisation est terminée, ouvrez l’onglet analyse et cliquez sur afficher la carte pour sélectionner les cellules individuelles qui passent les critères d’étude.
Centrez le microcapillaire en verre au milieu de la vue en direct du microscope et ouvrez l’onglet de la pompe. Pour créer un vide, rétractez le piston d’une seringue numéro un de 50 millilitres de quatre millilitres et ouvrez l’onglet de tri. Pour permettre la prise d’une seule cellule, réglez la vanne deux pour qu’elle soit ouverte pendant 120 millisecondes et celle de la vanne à ouvrir pendant 20 millisecondes après un laps de temps de 200 millisecondes.
Pour permettre à la cellule choisie d’être livrée avec succès à son tube PCR contenant un tampon de lyse, réglez la valve à ouvrir pendant 20 millisecondes et la valve deux à ouvrir pendant 10 millisecondes après un laps de temps de 10 millisecondes. Lorsque les paramètres de la vanne ont été ajustés, cliquez sur calculer le chemin. Le logiciel calculera le chemin le plus rapide d’une cellule à l’autre pour ramasser et injecter les cellules sélectionnées dans toute la puce.
Ensuite, concentrez le microscope sur un motif sur la surface de la puce. Utilisez le joystick pour déplacer le microcapillible vers le bas soigneusement afin que l’image la plus nette de la pointe du microcapillaire peut être obtenue sans toucher la surface de la puce et cliquez sur ensemble. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira, montrant la coupe transversale microcapillaire.
Pour que le logiciel enregistre le décalage de pointe du capillaire dans les coordonnées X, Y et Z, cliquez sur le centre exact du capillaire. Ensuite, cliquez sur commencer le tri pour lancer le tri. Dans cette analyse représentative de l’ADND pré-amplifié à partir d’une seule cellule choisie, une bande claire dans le gel comme la parcelle de densitométrie a été observée correspondant au pic à 1 852 paires de base dans l’électrophéogramme.
La taille moyenne des fragments était de 1588 paires de base avec un petit nombre de fragments qui étaient plus courts que 300 paires de base, ce qui indique la génération d’une bonne bibliothèque cDNA. La coloration et l’analyse immunofluorescentes peuvent également être exécutées pour évaluer la structure de sarcomere dans les cardiomyocytes modelés. Cette plate-forme ouvre la voie à l’étude à haut débit et le dépistage des médicaments de différents types d’insuffisance cardiaque.
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