Analyse af SEC-SAXS-data via EFA-deconvolution og Scatter

Biologiske små-vinkel x-ray spredning giver strukturelle målinger af makromolekyle og makromolekylære komplekser. Ideelt set skal den prøve, der skal måles, monodisperseres. Selv om størrelsesudelukkelseskromatografi SAXS i nogle tilfælde ikke er tilstrækkelig til at producere monodispersitet, kan der udføres en softwarebaseret deconvolution af SAXS-dataene for at frembringe en idealiseret SAXS-kurve.

Efter denne protokol, en deconvolution program og den brugervenlige Scatter program kan bruges til at analysere Vaccinia virus DNA polymerase exominus mutanter. Hvis du vil udføre en baggrundsundertraktion af størrelsesudelukkekromatografidata, skal du åbne det Java-baserede Punkt 4-program og åbne fanen SEK. Træk og slip de reducerede datafiler ind i slipdataene under vinduet, og klik på outputmappeknappen, og åbn for at indstille den outputmappe, hvor dataene gemmes.

Angiv eksempelnavnet i feltet Gem som, og klik på spor. Klik på knappen rediger detaljer for at redigere de eksperimentelle detaljer og udfylde de relevante felter. Hvis du vil markere bufferrammerne manuelt, skal du klikke på angiv buffere.

Venstreklik og træk for at markere bufferen som en flad på sporingskurven før den ugyldige diskenhed i størrelsesudelukkekromatografikolonnen på ca. 100 billeder, og klik på angiv buffer og opdatering for at genberegne SEC-filen. Venstreklik og træk for at vælge et område af interesse på signalplottet og venstreklik, og træk krydshårene i varmekortplottet for at vælge zoom og undersæt af rammer, der skal bruges til fletning. Med et andet venstreklik skal du fremhæve rammerne på varmekortet, der svarer til området nederst til højre på trådkorset.

Ideelt set bør rammen fremhæve en region med en overvejende cyan farve og en stabil radius af gyration. Når du er tilfreds med de markerede rammer, skal du klikke på fletning for at flette de fratrerede rammer og klikke på analysefanen for at få vist dataene. Ved deconvolution af dataene skal datasættet indlæses i deconvolutionsprogrammet.

I kontrolpanelet under filer skal du bruge mappesymbolet til at finde dataene og fremhæve alle DAT-filerne. Der trækkes et plot af integreret intensitet versus rammenummer i serieplottet. Klik under seriefanen for at fremhæve kurven og åbne pop op-vinduet til LC-analyse.

Hvis du vil vælge et passende bufferområde, skal du klikke på tilføj område for at vælge et område før kromatogrammets højdepunkt og et efter opløsningsmiddelfronten og klikke på sætbufferen. Pop op-vinduer angiver, at der ikke er valgt rammer for baggrunden. Hvis du vil starte efa’en, skal du højreklikke på den fremhævede fil og vælge EFA i menuen.

I pop op-vinduet skal datasættets enhedsværdiopsætning overholdes. Markér værdierne i kontrolelementerne for at bekræfte, at hele det topområde, der skal deconvolutere, er dækket af intensitetsplottet. Handlingen med entalsværdier viser intensiteten af entalsværdierne over grundlinjen.

Hvis venstre og højre enkeltvektorer ikke stemmer overens, skal du ændre det signifikante ental til to og flytte rammerne, indtil venstre og højre entalsvektorer er ens. Den europæiske sikkerhedstilk sådan vil blive beregnet, der genererer observationsområder i frem- og tilbageadgående retninger for hver vektor, og angiver, hvornår komponenterne starter og afslutter løsningsprofilen for de valgte størrelsesudelukkekromatografi SAXS-data. RAW vil forsøge at identificere intervallerne.

Hvis det er nødvendigt, skal du bruge pilene til at ændre intervallerne, så hver cirkel er starten på et vendepunkt, der stiger fra eller falder til grundlinje, og klik derefter. Hvis du vil reducere eller eliminere pigge, skal du identificere omtrentligt, hvilken ramme der svarer til spidsen, ved hjælp af områdekontrolpilene for at justere kontrolelementet i komponentområdet. Når der er opnået et minimum chi-kvadrat, skal du klikke tilbage for at udføre en valideringskontrol.

Hvis de oprindelige efa-plots stadig ser gyldige ud, skal du klikke på næste og gemme EFA-data for at gemme plots. Klik derefter på gjort for at lukke EFA-vinduet. Åbn derefter profiler i panelet afbildning i RAW-vinduet for at få vist kurverne.

Højreklik på under fanen Profiler i kontrolpanelet for at gemme kurverne som DAT-filer. Under SAXS-bestemmelse skal du åbne punktanalysefanen og vælge G for at vælge det manuelle Guinier-analyseværktøj. I plottet, tilføje eller fjerne punkter, således at resterne ikke har et smil eller rynke panden funktion.

De valgte data i Guinier-pasformen må ikke overstige den maksimale kø ganget med en radius af gyrationsgrænsen på 1,3. Klik normaliseret Kratky. Den resulterende plot giver en vurdering af den strukturelle tilstand af makromolekyle, kugleformede, cylindrisk, uordnede, normaliseret for masse, og koncentration.

Klik på korrelation. Den samlede spredte intensitet og et integreret område af den samlede spredte intensitet som funktion af Q-områder vises som en hurtig reference til validering af spredningskurvens kvalitet. Klik på fleksibilitet for at starte fleksibilitetsanalysen.

Hvert panel i popup-vinduet vil vise et plot udnytter en magt lov forhold, der eksisterer mellem den kompakte og den aflange fleksible biopolymerer. Brug skyderen nederst i feltet til at ændre visningen af dataene, indtil et plateau i et af observationsområdeerne er nået. Klik på diskenhed umiddelbart efter, at du har udført en fleksibilitetsanalyse.

En popup af tre grafer vil blive genereret. Porod-Debye plottet spor, hvor skyderen fra fleksibilitet plot blev efterladt og viser plateaued område data. For at beregne mængden af partiklen skal du flytte start- og slutpunkterne, indtil den blå linje på observationsområdet passer til plateauområdet.

For et objektivt resultat, bør resterne i Porod-Debye eksponent magt lov passer ikke vise noget mønster. Under fanen P af R kan den reelle rumfordeling og spredningskurven for prøven observeres. Ideelt set bør fordelingen kurven være glat uden bølger og bør bare forsigtigt røre x-aksen.

Højreklik på eksempelnavnet, og klik på Find DMAX for at åbne et nyt vindue. Grænserne for den maksimale dimension er forudindstillet med det foreslåede maksimale Q-område, de maksimale datapunkter, der skal bruges til beregningen, de lavere og øvre maksimale dimensionsgrænser og en lavere og øvre alfascore. Klik på start.

Der oprettes en sammensat fordeling sammen med et foreslået maksimumdimensions- og alfaniveau. Hvis disse data er acceptable, skal du lukke vinduet for at vende tilbage til fanen P af R, hvor det gensidige rumplot nu beskæres, så det svarer til det foreslåede maksimale Q-område. Vælg den flere model, og klik på baggrund for at indstille alfaniveauet og den maksimale dimension til de foreslåede værdier fra pop op-boksen.

Klik på Forfine. Der åbnes et krydsvalideringsplot, der viser, om der måtte afvises point som angivet med rødt. Hvis der kun er et par afviste punkter, og fordelingen ser godt ud, så modellen er god.

Du skal udskrive en rapport under fanen Analyse. Venstreklik for at fremhæve eksemplet og højreklikke på eksempelnavnet. Vælg opret rapport fra det enkelte datasæt.

Der åbnes en tekstboks, der tillader kommentarer, og der oprettes et PDF-dokument, der viser alle de genererede tal og værdier. I denne repræsentative analyse, E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant var bundet til DNA og køre ved hjælp af størrelse udelukkelse kromatografi lille vinkel x-ray spredning. Der blev observeret to toppe.

Den første store top repræsenterer E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant DNA kompleks. Og den anden angiver den ubundne tilstand. Mens den klassiske tilgang med at vælge rammer giver en stabil radius af gyration af komplekset i den første top, er den anden top klart fusioneret og radius af gyration på tværs af plottet viser, at den anden top af interesse ikke har en stabil radius af gyration på grund af cross-peak forurening.

I denne analyse kunne der kun anvendes fem rammer, der viste en semi-stabil radius af gyration. Når de blev trukket fra, gav de en radius af gyration på 36,3 angstroms. Når toppe blev deconvoluted ved hjælp af MILJØMÆSSIGE Fokus, den tilsvarende kurve for den anden top blev overlejret med den oprindelige, viser et klart fald i signalet til støj og lavere radius af gyration af 34,1 angstroms.

Et kratky plot af dataene afslører, at komplekset med den indviklede top er mere kugleformet som bekræftet af PR-kurven, hvilket giver en maksimal dimension på 108,5 angstroms for den dekonvoluterede kurve. De ikke-deconvoluterede data til denne analyse er mere aflange med en maksimal dimension på 120 angstroms, sandsynligvis på grund af den heterogenitet, der opstår som følge af den ubundne E9 polymerase minus exonuclease mutant. De mest kritiske trin er at vælge entalsværdierne og det dataområde, der bruges, da disse i høj grad påvirker nøjagtigheden af deconvolutionen.

Resultaterne bør ikke tages på egen hånd, men vurderes yderligere ved hjælp af yderligere teknikker såsom analytisk centrifugering eller multivinkel laserlysspr spredning for at muliggøre deres biologiske fortolkning. In-line kolonne-koblet SAXS i kombination med deconvolution og en brugervenlig grænseflade som programmet Scatter giver er en kraftfuld pakke til at give meningsfulde strukturelle data, selv fra iboende vanskelige systemer.