Quantificação do DNA específico do porco circulante no sangue de um modelo de xenotransplante

Xenotransplante é um método viável para tratar No entanto, o monitoramento efetivo da rejeição imune do xenotransplante é um problema para médicos e pesquisadores. Este protocolo é um método simples, conveniente, de baixo custo e menos invasivo para monitorar a rejeição imune da xenotransmutação. Essa técnica pode ser usada no campo do xenotransplante, incluindo transplante de ilhotas de porco para humano, transplante de rim, transplante de fígado e transplante de coração.

Comece transferindo 500 microliters de amostras de sangue para diferentes tubos de microcrífugas. Adicione 20 microliters de protease K e 500 microliters de tampão de lise nos tubos. Em seguida, agite-os completamente para misturar.

Coloque os tubos em um banho de água a 56 graus Celsius por 10 minutos, sacudindo-os duas a três vezes durante a incubação até que a solução fique clara centrífuga-los brevemente para remover as contas líquidas da parede interna das tampas do tubo. Em seguida, adicione 500 microliters de Anidro, Álcool Etílico e agite bem. Transfira a mistura para a coluna de adsorção.

Em seguida, centrifufique a coluna por dois minutos e descarte o líquido de resíduos. Adicione 800 microliters de solução de enxágue a cada coluna de adsorção e centrífuga por um minuto. Deixe as colunas em temperatura ambiente por alguns minutos para secar a solução restante de lavagem.

Transfira as colunas de absorção para um tubo centrífugo limpo. Adicione 50 microliters de tampão de elução ao meio dos filmes de adsorção e coloque-os em temperatura ambiente por dois a cinco minutos, depois centrifuá-los por um minuto. Prepare a mistura mestre pcr de acordo com as instruções do manuscrito, em seguida, adicione 23 microliters da mistura em cada tubo de micro centrífugas de 0,6 mililitro.

Adicione dois microliters de DNA genômico a cada tubo e cuidadosamente Cabot. Em seguida, misture brevemente e centrífuga. Coloque os tubos em um ciclofaixador PCR e inicie a amplificação.

Quando a reação terminar, realize a agarose eletroforese. Adicione 1,2 gramas de Agarose em um frasco contendo cem milímetros de TAE e ferva-o por cinco minutos no micro-ondas. Uma vez que a Agarose tenha esfriado a aproximadamente 70 graus Celsius, adicione cinco microliters de corante de ácido nucleico no frasco, lentamente, despeje-o na placa e deixe-o em temperatura ambiente até que se solidifique em um gel.

Adicione cinco microliters de cada amostra e 2-Log DNA Ladder ou DNA Marker 1, nos poços do gel agarose e eletroforese em 120 milhões de píer até que as bandas sejam separadas. Visualize o gel com um imager ultravioleta. Após realizar a transformação conforme descrito no manuscrito do texto, verifique os plasmídeos por dupla restrição de digestão enzimática com EcoR I e Bam HI. Separe os produtos digeridos com eletroforese 1%Agarose e exponha o gel à luz UV.

Diluir o plasmídeo concentrado com o fragmento de DNA suíno para duas vezes 10 a 11 cópias por mililitro para a solução padrão inicial, Usando água dupla destilada. Para estabelecer uma curva padrão, prepare uma mistura mestre qPCR, conforme descrito no manuscrito do texto e adicione 40 microliters da mistura em cada tubo de uma tira de oito tubos. Adicione 10 microliters de DNA padrão de diferentes concentrações, tampa os tubos e, em seguida, misture-os brevemente e centrífuga-los.

Coloque os tubos na máquina qPCR e realize a amplificação. Use tubos EDTA para coletar amostras de sangue de cerca de 400 microliters dos modelos de remendo da artéria de porco para macaco, ou 100 microliters dos modelos de transplante de células de porco para rato. Em seguida, transfira as amostras para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.

Remova as células sanguíneas das amostras de sangue por centrifugação a baixa temperatura e alta velocidade. Transfira o supernante para um novo tubo centrífuga de 1,5 mililitros e remova os detritos celulares por centrifugação a 16.000 vezes G por 10 minutos. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e extraia o DNA circulante usando um soro comercial enquanto circulava o kit de extração de DNA.

Condensar o volume de DNA circulante para 40 microliters e armazená-lo a 20 graus Celsius negativos. Realize qPCR para quantificar o DNA específico do porco circulante. Primers específicos de suínos foram projetados e usados para quantificar DNA específico de porco circulante por qPCR, em modelos de transplante de células de porco para rato e patch de artéria de porco para macaco, modelos de transplante.

A eletroforese agarose foi usada para isolar fragmentos de DNA amplificados. Utilizando PCR, foram identificados os primers específicos para DNA genômico porcina amplificada. Em seguida, foram confirmadas as especificidades dessas primers na coorte de dna genômico de macacos ou humanos ou na coorte de DNA genômico do rato.

Finalmente, dois primers específicos de espécies foram usados para amplificar o DNA de porco no patch da artéria de porco para macaco e modelos de transplante de células. A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este protocolo é que a contaminação de todos os tipos deve ser evitada. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores explorarem novas questões dentro da xenotransplante, pois é um método simples de baixo custo e não invasivo para monitorar a rejeição imune da xenotransplante.