Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Utforske fettvevsstruktur av Methylsalicylate Clearing og 3D Imaging
Chapters
Summary August 19th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi en enkel, billig og rask clearing metode for å løse 3D-strukturen av både mus og humant hvitt fettvev ved hjelp av en kombinasjon av markører for å visualisere vaskulatur, kjerner, immunceller, nevroner og lipid-dråpefrakkproteiner ved fluorescerende bildebehandling.
Transcript
Disse protokollen tillater analyse av tredimensjonal struktur av Svært stort menneske på musen fettvev ballett mikroskopi. Tilrettelegge koblingen av patologisk dysfunksjon med fettvev strukturelle endringer. Denne ryddeprosessen er veldig enkel, veldig godt tilpasset å rydde menneskelig på varme mus fettvev og bruke mindre giftig løsningsmiddel som etanol eller metylsallisat sammenlignet med andre klare protokoller.
Begynn med å senke den høstede musen eller humant hvitt fettvev i minst 10 milliliter med 4% effekt formaldehyd i PBS i et 15 milliliter plastrør fortrinnsvis under en kjemisk hette. Rist vevet på en rullende plate ved romtemperatur i en time før du overfører røret til en rullende plate ved fire grader Celsius over natten. Neste morgen skyller du det faste hvite fettvevet i 10 milliliter PBS i fem minutter ved romtemperatur for å fjerne alle spor av fikseringsmiddel og overføre vevet til et 15 milliliter rør som inneholder 10 milliliter 0,3% glysin i PBS i en time inkubasjon ved romtemperatur på en orbital shaker ved 100 omdreininger per minutt.
Når de resterende frie aldehydgruppene har blitt slukket, dypp vevet i et 15 milliliter rør som inneholder 10 milliliter på 0,2% Triton X-100 i PBS for en to timers inkubasjon med risting ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen behandle vevet med 10 milliliter på 0,2% Triton X-100 og 20% DMSO med risting på 37 grader Celsius over natten. Neste morgen fordyper vevet i et 15 milliliter plastrør som inneholder 10 milliliter 0,1% Tween 20, 0,1% Triton X-100, 0,1% deoksycholate og 20% DMSO i PBS i minst 24 timers inkubasjon ved 37 grader Celsius med risting.
På slutten av inkubasjonen, skyll vevet med 10 milliliter på 0,2% Triton X-100 i PBS på en orbital shaker ved 100 omdreininger per minutt i en time. Etterfulgt av nedsenking i 15 milliliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i 12 timer ved 37 grader Celsius med risting. For farging av det hvite fettvevet.
Overfør vevet til 300 mikroliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS, supplert med de primære antistoffene av interesse i et 1,5 milliliter mikrorør beskytter det mot lys med aluminiumsfolie og plasserer røret i et 50 milliliter Falcon-rør. Plasser røret i orbital shaker for en to dagers inkubasjon på 37 grader Celsius med risting. På slutten av inkubasjonen skylle vevet to ganger i 10 milliliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i fem timer ved 37 grader Celsius med risting og beskyttelse mot lys.
Etter den andre skyll vask vevet i 10 milliliter friske 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA og PBS i 16 til 48 timer ved 37 grader Celsius med risting, Deretter overføre vevet til en 1,5 milliliter rør som inneholder 300 mikroliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS, supplert med passende sekundære antistoffer og beskytte røret mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie. Etter en to dagers inkubasjon ved 37 grader Celsius på en shaker, vask vevet to ganger i 10 milliliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i fem timer ved 37 grader Celsius med risting beskyttet mot lys. Etter den andre vasken, skyll vevet inn i et rør som inneholder 10 milliliter friske 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i 16 til 48 timer ved 37 grader Celsius med risting og lysbeskyttelse.
Etterfulgt av en to timers vask i 10 milliliter PBS alene ved 37 grader Celsius med risting og lysbeskyttelse. For hvit fettvevsrydding på slutten av PBS vask ned vevet og 10 milliliter av en stigende sende etanol konsentrasjonsserie for en to timers inkubasjon per konsentrasjon ved romtemperatur med risting beskyttet mot lys som angitt. Neste morgen dypp vevet i en 20 milliliter glassflaske med en plasthette som inneholder fem milliliter metylsalylat i en røykhette.
Det hvite fettvevet er fortsatt tydelig synlig på dette stadiet. Rist beholderen beskytte den mot lys ved romtemperatur i minst to timer. Det hvite fettvevet blir helt transplantasjon.
For 3D confocal avbildning av farget og ryddet hvitt fettvev montere et metallisk bildekammer utstyrt med en glassbunn og i en røyk hette overføre vevet til kammeret. Fyll kammeret med fersk metylsallisylat. Fullføre montering av kammeret ved å legge til et lite deksel slip for å stabilisere vevet og et stort deksel slip for å lukke kammeret.
Plasser kammeret på et omvendt konfokalt mikroskopstadium for vevsavbildning ved lav forstørrelse for å generere noen kubikkcentimeter 3D-kart over hele fettvevsprøven. Etter 3D-kartgenerering bruker du et 20X langdistanseluftmål som gir et godt forhold mellom oppløsning og dybde for å velge flere områder for vevsprøvetaking ved en høyere forstørrelse. For cellesegmentering konvertere 3D-stabler til programvareformatet for å frigjøre minneplass.
Før du åpner cellemodulen til programvaren. Endre celledeteksjonsinnstillingen til plasmamembranfarging og velg den fluorescerende kanalen til markøren som brukes til å avgrense celle periferien. Deretter definerer du terskler, gir et område av de forventede cellestørrelsene og kjører segmenteringen.
Påvirkningen av å rydde på menneske og mus hvitt fettvev kan observeres med det blotte øye. Clearing forbedrer også bildedybden av vevet som er i stand til å bli kjøpt. Og forenkler hele vev 3D-bildebehandling og 3D kart generasjon ut av 4X forstørrelse.
3D-kartlegging gjør det mulig å få videre valg av ulike interesseområder ved en 20X forstørrelse til en dybde på to millimeter. Spesifikk farging av lipiddråper og adipocytter kan oppnås ved hjelp av henholdsvis perilipin- og anti-GLUT4-antistoffer. Blodårene kan oppdages ved hjelp av enten CD31 antistoff eller intravenøs injeksjon av Lectin DyLight 649 kort tid før offer.
Makrofager og T-celler kan visualiseres ved hjelp av anti CD301 fykoerytrin antistoff og anti TCR beta Pacific blå antistoff. Det perifere nervenettverket kan oppdages ved hjelp av anti tyrosinhydroksylaseantistoff. Ved hjelp av disse merkingene kan gjennomsnittlig størrelse og størrelsesfordeling av adipocytter og blodkarnettverkstettheten i fettvevet bestemmes.
Det er avgjørende å følge yrkestiden som demonstrert fordi dårlig prøveforberedelse ikke vil resultere i god bildekvalitet. Denne protokollen kan kombineres med avansert bildebehandlingssystem eller kan kombineres til etterbehandling bildeanalyse freeware.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
