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体外楔形切片准备模拟在Vivvo神经元电路连接

脑片实验允许以高电和时间分辨率来测量神经元功能，但这些切片通常切断许多前突触连接。楔形切片可保持更完整的前突触电路。这种经过改良的大脑切片可维持更完整的体内神经回路，同时提供体外实验的好处，如视觉引导的贴片夹记录、药理学和活动成像。

准确的楔形切片几何体可以根据电路中神经元的地图集位置进行估计，但前突触示意图和轴突的完整性应使用组织学确定。首先使用剃刀刀片将头骨中线的皮肤从鼻子切到颈部后面。剥回皮肤，露出头骨，从头骨底部开始，继续向鼻子走去，用小剪刀在头骨中通过中线进行切口。

在羔羊缝合时，将头骨从中线横向切向两侧的耳朵，剥回头骨以暴露大脑。从角端开始，用一个小的实验室铲子轻轻地将大脑从头骨上抬起来，让视神经被切断。继续轻轻地向后工作大脑，露出腹体表面，用细钳小心地捏紧脑干心腹表面附近的三叉神经，切开它们。

将制剂放在装满冷切片溶液的玻璃培养皿中，然后将盘子放在解剖显微镜下。修剪靠近脑干的面部神经，以暴露前脑神经。使用精细钳子将尖端推入前脑，其中前骨神经尽可能离开头骨。

捏断两侧的神经，使神经根附着在脑干上。从梯形体附近的脑干的腹面取出脑和血管。然后捏住剩余的颅神经和结缔组织，使大脑完全从头骨中释放出来，如果可能，注意保留剩余的脊髓。

准备大脑表面的夹具到舞台放置大脑腹侧，并使用钝器轻轻地固定脊髓，以稳定脑组织。将打开的钳子以大约 20 度的角度通过大脑插入到盘子的底部，使尖端从脑部到光学切口的后面，并使用剃刀刀片沿钳子切割。接下来，准备一个四分之一厘米的4%的块，并展开一小滴胶水到舞台上的矩形。

使用钳子小心地抬起大脑，用纸巾边缘轻轻涂抹多余的液体。然后将阻塞的表面放在胶水上，使腹体表面在切片过程中朝向刀片的方向，并将粘液块轻轻地推到背部表面作为支撑。为了获得楔形片，用耳蜗神经根在厚的一侧和中层寡头神经元和梯形身体的中核在薄的一面，将磁盘与连接的大脑到舞台持有人，并放置在振动器的切片室与大脑的腹腔表面朝向刀片。

用冰冷切片溶液填充腔室，将刀片放入碳原气泡溶液中。将切片切割到感兴趣区域，以确保切片是对称的。然后将舞台移向一侧约 15 度。

继续小心切开，直到听觉神经根靠近一侧的表面，面部神经在切片的另一侧表面可以看到。将舞台 15 度移回原始位置，然后将刀片从组织上移出。旋转舞台底座 90 度，使薄侧的横向边缘朝向刀片，并降低刀片几百微米，然后慢慢使刀片靠近组织的边缘。

刀片缩回后，刀片稍微降低到刀片薄边缘所需的厚度。将刀片从组织移回，然后旋转舞台底座，使腹体表面朝向舞台底座。进行切割以指定楔形切片的轮面表面，然后将切片转移到一平方厘米的界面纸上。

面部神经应该在旋转面的切片的两个半球上可见。然后将切片移动到35摄氏度的孵化室，以恢复30分钟。要设置用于电生理学分析的楔形切片，将样品放入连续注入 35 摄氏度 ACSF 的录音室并稳定切片。

使用 DIC 光学器件，聚焦切片厚侧的听觉神经根，并使用微操纵器将双极钨刺激电极移动到听觉神经根部，并轻轻地移动到组织表面。将视场移动到薄侧的梯形体体的腹核，并使用 561 纳米发射过滤器选择中层橄榄神经作为荧光下贴片夹电生理学的目标。在记录移液器上为建议的实验和 DIC 光学贴片填充，并在全细胞配置中从中端胆光神经中记录。

调整听觉神经根的电刺激幅度，在中枢神经中获得一致的后突触事件。然后运行适当的刺激方案，观察中层胆汁神经元中唤起的突触电流。这种楔形切片制备旨在包含听觉神经根和耳蜗核对等的中层卵石耳神经元进行记录。

在这个紫红色染色的楔形切片中，耳蜗核几乎存在于其完全的角体-孔体范围内。听觉神经根进入耳蜗核。此外，楔片包含梯形体异形体中核的神经元，从中层卵细胞状神经元进行记录。

要确认楔片中的神经连接，通过两种方式刺激。首先，中线的腹体声学石质受到电刺激，通过球状浓密细胞轴突刺激直接激活T-stte轴突和梯形体神经元的中层核，并产生在中层胆囊神经元上测量的后突触电流。然后刺激听觉神经根激活整个单声道上升脑干回路，并唤起后突触反应。

将直接刺激腹外声斯特里亚引起的第一个后突触电流的发作延迟测量与听觉神经刺激引起的电流进行比较，可发现听觉神经刺激事件的延迟明显较长，表明在听觉神经刺激期间激活的额外人工耳蜗核突触引起的突触延迟。使用解剖地标和仔细操纵磁碟阶段对于创建具有完整神经元电路和可靠的突触后唤起反应的楔形切片至关重要。这种切片技术为使用额外的体外电生理学工具提供了一个平台，包括钙或电压成像、光遗传学、神经递质解热以及细胞内和细胞外药理学。