Neuroscience
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विवो न्यूरोनल सर्किट कनेक्टिविटी में नकल करने के लिए इन विट्रो वेज स्लाइस तैयारी
Chapters
Summary August 18th, 2020
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न्यूरॉन्स के लिए विविध सिनैप्टिक आदानों का एकीकरण सबसे अच्छा एक तैयारी है कि प्राकृतिक समय और सर्किट प्लास्टिसिटी के लिए सभी पूर्व सिनैप्टिक नाभिक को बरकरार रखता है में मापा जाता है, लेकिन मस्तिष्क स्लाइस आम तौर पर कई कनेक्शन तोड़ । हमने विट्रो प्रयोग क्षमता को बनाए रखते हुए वीवो सर्किट गतिविधि में नकल करने के लिए एक संशोधित मस्तिष्क टुकड़ा विकसित किया।
Transcript
मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोग उच्च विद्युत और लौकिक संकल्प के साथ न्यूरोनल फ़ंक्शन से पूछताछ की अनुमति देते हैं, लेकिन ये स्लाइस आमतौर पर कई प्रेसिनैप्टिक कनेक्शन तोड़ देते हैं। एक कील के आकार का टुकड़ा अधिक बरकरार प्रेसिनैप्टिक सर्किटरी रखता है। यह संशोधित मस्तिष्क टुकड़ा विवो-जैसे न्यूरोनल सर्किट में अधिक पूर्ण रखता है, जबकि इन विट्रो प्रयोग के लाभ प्रदान करता है, जैसे नेत्रहीन निर्देशित पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग, फार्माकोलॉजी और गतिविधि इमेजिंग।
सर्किट के भीतर न्यूरॉन्स के एटलस स्थानों के आधार पर सटीक वेज कटा हुआ ज्यामिति का अनुमान लगाया जा सकता है, लेकिन प्रेसिनैप्टिक स्कीमा और एक्सॉन की अखंडता हिस्टोरोलॉजी का उपयोग करके निर्धारित की जानी चाहिए। नाक से गर्दन के पीछे तक खोपड़ी के मिडलाइन पर त्वचा को काटने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके शुरू करें। खोपड़ी को बेनकाब करने और खोपड़ी के आधार पर शुरू करने और नाक की ओर जारी रखने के लिए त्वचा को वापस छीलें, मिडलाइन के माध्यम से खोपड़ी में चीरा लगाने के लिए छोटी कैंची का उपयोग करें।
लैम्ब्डा सीवन में, मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी को वापस छीलने के लिए दोनों तरफ कान की ओर मध्यरेखा से खोपड़ी में कटौती करें। रोस्ट्रल एंड से शुरू, ऑप्टिक नसों को कटे होने की अनुमति देने के लिए धीरे-धीरे खोपड़ी से मस्तिष्क को उठाने के लिए एक छोटी प्रयोगशाला स्पैटुला का उपयोग करें। धीरे से मस्तिष्क को पीछे की ओर काम करना जारी रखें, वेंट्रल सतह को उजागर करें और उन्हें काटने के लिए ब्रेनस्टेम की वेंट्रल सतह के पास ट्राइजेमिनल नसों को ध्यान से चुटकी लेने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें।
तैयारी को ठंडे टुकड़ा करने की क्रिया के घोल से भरे ग्लास पेट्री डिश में रखें और डिश को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। वेस्टीबुलोकोचलियर नसों को बेनकाब करने के लिए चेहरे की नसों को ब्रेनस्टेम के करीब ट्रिम करें। सुझावों को फोरमिना में धकेलने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें जहां वेस्टीबुलोकोचलियर तंत्रिका जहां तक संभव हो खोपड़ी से बाहर निकलती है।
दोनों तरफ की नसों को तोड़ने के लिए चुटकी, ब्रेनस्टेम से जुड़ी तंत्रिका जड़ को छोड़ दें। ट्रैपेजॉइड शरीर के पास ब्रेनस्टेम की वेंट्रल सतह से मेनिंग्स और वैक्यूलेचर को हटा दें। फिर शेष कपाल नसों और संयोजी ऊतक चुटकी मस्तिष्क पूरी तरह से खोपड़ी से मुक्त करने के लिए, शेष रीढ़ की हड्डी को संरक्षित करने के लिए ध्यान दे, यदि संभव हो तो ।
चरण में स्थिरता के लिए मस्तिष्क की सतह तैयार करने के लिए मस्तिष्क वेंट्रल साइड को ऊपर रखें और मस्तिष्क के ऊतकों को स्थिर करने के लिए रीढ़ की हड्डी को धीरे से स्थिर करने के लिए एक कुंद उपकरण का उपयोग करें। डिश के नीचे करने के लिए मस्तिष्क के माध्यम से एक लगभग 20 डिग्री कोण पर खुला संदंश डालें ताकि युक्तियां ऑप्टिक चिम करने के लिए मस्तिष्क कौडल की पृष्ठीय सतह से बाहर निकलें और संदंश के साथ कटौती करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें । इसके बाद, 4% एगर का एक घन सेंटीमीटर ब्लॉक तैयार करें और चरण पर एक आयत में गोंद की एक छोटी बूंद फैलाएं।
मस्तिष्क को ध्यान से उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें और धीरे-धीरे एक पेपर तौलिया के किनारे के साथ अतिरिक्त तरल को डब करें। फिर अवरुद्ध सतह को गोंद पर रखें ताकि वेंट्रल सतह टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान ब्लेड की दिशा का सामना कर रही हो और एक समर्थन के रूप में पृष्ठीय सतह के खिलाफ धीरे-धीरे आगर ब्लॉक को धक्का दे। मोटी तरफ कॉकलियर तंत्रिका जड़ और मध्य तर ओलिवोकोक्लियर न्यूरॉन्स और पतली तरफ ट्रैपेज़ोइड शरीर के मध्यीय नाभिक के साथ कील स्लाइस प्राप्त करने के लिए, चुंबकीय डिस्क को संलग्न मस्तिष्क के साथ चरण धारक पर रखें और धारक को ब्लेड की ओर उन्मुख मस्तिष्क की वेंट्रल सतह के साथ कंपन के टुकड़ा करने वाले कक्ष में रखें।
बर्फ ठंड टुकड़ा करने की क्रिया समाधान के साथ चैंबर भरें और कार्बोजन बुलबुला समाधान में ब्लेड कम। स्लाइस सममित हैं सुनिश्चित करने के लिए ब्याज के क्षेत्र में कट स्लाइस कौडल। फिर चरण को लगभग 15 डिग्री एक तरफ शिफ्ट करें।
जब तक श्रवण तंत्रिका जड़ एक तरफ सतह के करीब न हो जाए तब तक ध्यान से टुकड़ा करना जारी रखें और चेहरे की तंत्रिका को स्लाइस के दूसरी तरफ की सतह पर देखा जा सकता है। चरण 15 डिग्री को मूल स्थिति में वापस स्थानांतरित करें और ब्लेड को ऊतक से दूर ले जाएं। मंच आधार 90 डिग्री स्पिन इतना है कि पतली तरफ के पार्श्व किनारे ब्लेड का सामना करना पड़ रहा है और धीरे से ऊतक के किनारे के करीब ब्लेड लाने से पहले ब्लेड कई सौ माइक्रोन कम।
ब्लेड के साथ स्लाइस के पतले किनारे की वांछित मोटाई के लिए ब्लेड को थोड़ा कम कर दिया। ब्लेड को ऊतक से वापस ले जाएं और स्टेज बेस को वापस स्पिन करें ताकि वेंट्रल सतह चरण आधार का सामना कर सके। वेज स्लाइस की रोस्ट्रल सतह को नामित करने के लिए एक कट बनाएं और स्लाइस को इंटरफ़ेस पेपर कौडल सतह के एक वर्ग सेंटीमीटर टुकड़े में स्थानांतरित करें।
चेहरे की तंत्रिका रोस्ट्रल सतह पर स्लाइस के दोनों गोलार्द्धों पर दिखाई नी चाहिए। फिर स्लाइस को 30 मिनट के लिए ठीक करने के लिए 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन कक्ष में ले जाएं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी विश्लेषण के लिए कील टुकड़ा स्थापित करने के लिए नमूना एक रिकॉर्डिंग कक्ष में जगह है कि लगातार ३५ डिग्री सेल्सियस ACSF के साथ perfused किया जा रहा है और टुकड़ा स्थिर ।
डीआईसी प्रकाशिकी का उपयोग करके, स्लाइस के मोटे पक्ष पर श्रवण तंत्रिका जड़ पर ध्यान केंद्रित करें और एक माइक्रोमैनिपलेटर का उपयोग करें ताकि द्विध्रुवी टंगस्टन उत्तेजक इलेक्ट्रोड को श्रवण तंत्रिका जड़ में ले जाया जा सके और धीरे-धीरे ऊतक की सतह में जा सके। देखने के क्षेत्र को पतली तरफ ट्रैपेज़ाइड शरीर के वेंट्रल नाभिक में ले जाएं और 561 नैनोमीटर उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करके एपिफ्लोरेसेंस के तहत पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लक्ष्य के रूप में एक मध्यवर्ती ओलिवोकोक्लियर न्यूरॉन का चयन करें। प्रस्तावित प्रयोग के लिए उपयुक्त आंतरिक समाधान के साथ और डीआईसी ऑप्टिक्स पैच के तहत और पूरे सेल विन्यास में मध्यम ओलिवोकोक्लीयर न्यूरॉन से रिकॉर्ड के साथ एक रिकॉर्डिंग पिपेट भरें।
मध्यीय ओलिवोकोचलियर न्यूरॉन में लगातार पोस्टसिनैप्टिक घटनाओं को प्राप्त करने के लिए श्रवण तंत्रिका जड़ के विद्युत उत्तेजना आयाम को समायोजित करें। फिर मध्यीय ओलिवोकोचलियर न्यूरॉन्स में पैदा की गई सिनैप्टिक धाराओं का निरीक्षण करने के लिए उचित उत्तेजना प्रोटोकॉल चलाएं। इस वेज स्लाइस तैयारी को रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित मध्यीय ओलिवोकोकलियर न्यूरॉन्स के लिए श्रवण तंत्रिका जड़ और कॉकलियर नाभिक कॉन्ट्रालेट्रल को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
इस क्रेसिल वायलेट दाग वेज स्लाइस में कॉकलियर नाभिक लगभग अपने पूर्ण रोस्ट्रल-कौडल सीमा में मौजूद है। और श्रवण तंत्रिका जड़ कॉकलियर नाभिक में प्रवेश करते हुए देखा जाता है। इसके अलावा, वेज स्लाइस में ट्रैपेज़ाइड शरीर के मध्यीय नाभिक के न्यूरॉन्स होते हैं जो मध्यकालीन ओलिवोकोचलियर न्यूरॉन्स से होते हैं जिनसे रिकॉर्डिंग की जाती है।
एक वेज स्लाइस प्रेसिनैप्टिक इनपुट के भीतर न्यूरोनल कनेक्टिविटी की पुष्टि करने के लिए दो तरीकों से उत्तेजित होते हैं। सबसे पहले, मिडलाइन पर वेंट्रल ध्वनिक स्ट्राइट विद्युत रूप से उत्तेजित होता है, टी-स्टेलेट एक्सॉन को सीधे सक्रिय करता है और गोलाकार जंगली कोशिका एक्सॉन उत्तेजना के माध्यम से ट्रैपेज़ाइड शरीर न्यूरॉन्स के मध्यीय नाभिक और परिणामस्वरूप पोस्टसिनैप्टिक धाराएं होती हैं जिन्हें मध्यवंशीय न्यूरॉन पर मापा जाता है। श्रवण तंत्रिका जड़ तो पूरे मोनार्ल आरोही ब्रेनस्टेम सर्किटरी को सक्रिय करने और पोस्टसाइनाप्टिक प्रतिक्रियाओं को पैदा करने के लिए प्रेरित किया जाता है।
श्रवण तंत्रिका उत्तेजना के साथ पैदा किए गए वेंट्रल ध्वनिक स्ट्राइटा की सीधी उत्तेजना के साथ पैदा किए गए पहले पोस्टसिनैप्टिक वर्तमान के शुरुआत विलंबता उपायों की तुलना श्रवण तंत्रिका उत्तेजना घटना में काफी लंबी विलंबता का पता चलता है, जो श्रवण तंत्रिका उत्तेजना के दौरान सक्रिय अतिरिक्त कॉकलियर नाभिक सिंप्स के परिणामस्वरूप सिंपटिक देरी का संकेत देता है। शारीरिक स्थलों का उपयोग और चुंबकीय डिस्क चरण के सावधान पैंतरेबाज़ी बरकरार न्यूरोनल सर्किटरी और विश्वसनीय पैदा पोस्ट सिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं के साथ कील स्लाइस बनाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक कैल्शियम या वोल्टेज इमेजिंग, ऑप्टोजेनेटिक्स, न्यूरोट्रांसमीटर अनकेजिंग, और इंट्रासेलुलर और एक्सट्रासेलुलर फार्माकोलॉजी दोनों सहित अतिरिक्त इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरणों का उपयोग करने के लिए एक मंच प्रदान करती है।
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