Bioengineering
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Metabolsk profilering for å bestemme bakteriedrepende eller bakteriostatiske effekter av nye naturlige produkter ved hjelp av isotermisk mikrocalorimetry
Summary October 29th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Oppklaringen av handlingsmåten til et nytt antibiotika er en utfordrende oppgave i narkotikaoppdagelsesprosessen. Målet med metoden som er beskrevet her er anvendelsen av isotermisk mikrocalorimetry ved hjelp av calScreener i antibakteriell profilering for å gi ytterligere innsikt i interaksjoner mellom stoff og mikrobe.
Transcript
Forstå handlingsmåten til nye antibakterielle forbindelser er en viktig, men vanskelig oppgave. Denne metoden gir innsikt i slike mekanismer, og det er enkelt å implementere. Denne teknikken tillater en sanntidsobservasjon av antibakterielle effekter på en ikke-invasiv måte som muliggjør ytterligere prøveanalyse.
Selv om det å praktisere med mikrobiologiske teknikker er en forutsetning, er eksperimentet lett å utføre. Å ta deg tid med dataanalyse er svært viktig når du utfører mikroberegning for første gang. Begynn med å bruke et spektrofotometer ved en bølgelengde på 600 nanometer for å måle den optiske tettheten til nattkulturen.
Fortynn kulturen til en 5 ganger 10 til den femte koloniformingsenhetene per milliliter frisk MHB middels konsentrasjon og tilsett 150 mikroliter celler til hver 1,5 milliliter tube antibiotika ved konsentrasjon av interesse. Bland deretter forbindelsen med cellene ved å virvle. For å forberede innsatsene, tilsett 120 mikroliter av hver bakterieantibiotikumblanding i individuelle plastinnsatser i de riktige brønnene på en 48-brønns plate og bruk pinsett for å plassere alle titanhetsnealene i holderne.
Overfør innsatsene forsiktig inn i titanhettebreene i holderplaten og legg titanlokkene løst på alle hetteglassene. Når alle innsatsene er overført, plasserer du holderen på det angitte området på prøvestasjonen og bruker en momentnøkkel satt til 40 centinewton meter for å stramme alle lokkene. I systemprogramvaren starter du et nytt eksperiment og trekker prøveinnsettingsarmen tilbake fra instrumentet.
Plasser koppholderen på broen med kolonne åtte mot prøveinnsettingsåpningen og skyv forsiktig koppholderen inn i instrumentet i posisjon en. Vent 10 minutter til systemet stabiliserer seg før du merker de eksperimentelle brønnene. Deretter skyver du prøveinnsettingsarmen til koppholderen er i posisjon to.
Etter at systemet har stabilisert seg i 20 minutter, skyver du prøveinnsettingsarmen til posisjon tre og trekker inn prøveinnsettingsarmen til den er i løpestilling. Fremhev alle brønnene i programvaren og velg reaksjonsstart, og kjør deretter eksperimentet til varmeutslippene er stabilt tilbake på null. Velg stopp på slutten av analysen.
Programvaren vil da spørre om du er sikker. Velg ja, og lagre eksperimentet for dataanalyse. Sett deretter prøveinnsettingsarmen helt inn i instrumentet og sett magnetene inn for å hente koppholderen.
Hvis du vil analysere dataene, åpner du programvaren og velger åpent eksperiment. I popup-vinduet velger du eksperimentet av interesse og klikker åpent. Klikk merk alle, og definer opprinnelig plan for å normalisere dataene i hver posisjon.
I popup-vinduet velger du en tidsperiode på mer enn 30 minutter i forsinkelsesfasen. Etter valg vil grunnlinjen vises grønt i termogrammet. Lukk vinduet definer opprinnelig plan, og klikk deretter lagre og lukk programvaren.
Deretter åpner du den nettbaserte SymCel-kalorimetrianalyseapplikasjonen. Klikk bla gjennom for å laste opp filen av interesse og velg eksperimentet. De metabolske parametrene vil automatisk bli beregnet for de 32 prøvene.
Hvis du vil tilpasse varmeflytdataene til Gompertz- og/eller Richards Growth-modellene, klikker du vekstfunksjonen. Vekstmodeller vises i den kumulative delen for sammenligning med rådata i flytdelen. Hvis du vil laste ned de beregnede parameterne, klikker du på Nedlastingsmål, velger filplasseringen og klikker lagre.
Filen vil bli eksportert til et regneark for videre analyse. Her vises termogrammene oppnådd ved å utsette A.baumannii DSM-30008 til ciprofloksacin i seriell fortynning. Konsentrasjoner mellom 0,005 og 0,1 mikromos har en minimal effekt på A.baumannii vekst og metabolisme.
Behandling av cellene med 0,5 mikromolar ciprofloxacin fører imidlertid til en betydelig endring i forsinkelsesfasens varighet og til en lavere maksimal varmestrøm. Disse to endringene påvirker sammen tiden til toppen, noe som resulterer i en økning på ca. seks timer. I dette tallet plottes den kumulative frigjorte varmen mot tiden med effekten av hver konsentrasjon reflektert av en helling av skråningen.
Kvantifisering av termograminline muliggjør beregning av maksimal metabolsk rate av A.baumannii i nærvær av ciprofloxacin med samtidig reduksjon i metabolske rate observert i celler behandlet med 0,5 mikromolar ciprofloxacin. Rifampicin behandling har en dramatisk effekt på termogrammene i A.baumannii DSM-30008. En betydelig reduksjon av varmeutslipp korrelerer med en reduksjon i metabolsk aktivitet observeres også.
Legg merke til økningen i tid til topp for alle de testede konsentrasjonene og reduksjonen i metabolsk hastighet forårsaket av reduksjon i helling for alle konsentrasjonene som vanligvis tilskrives en bakteriedrepende effekt. For å sikre optimale resultater, bruk omvendt pipettering og forhindre ekstra væske på sidene av innsatsen når du overfører prøven, og pass også på at lokkene er ordentlig lukket.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
