Biology
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Identification, isolement et caractérisation des progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) et des progéniteurs myogéniques (MP) dans le muscle squelettique chez le rat
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Summary June 9th, 2021
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Ce protocole décrit une méthode pour isoler les progéniteurs fibro-adipogènes (PAF) et les progéniteurs myogéniques (MP) du muscle squelettique du rat. L’utilisation du rat dans les modèles de lésions musculaires offre une disponibilité accrue des tissus du muscle atrophique pour l’analyse et un plus grand répertoire de méthodes validées pour évaluer la force musculaire et la démarche chez les animaux en mouvement libre.
Transcript
Comme les FAP sont des médiateurs de la régénération musculaire et de la fibrose pathologique, notre protocole permet de caractériser la dynamique des FAP après une lésion musculaire et d’isoler les FAP pour des études in vitro ou ex vivo. À ce jour, des études ont été réalisées exclusivement sur des PAL isolés chez la souris. Notre protocole permet d’isoler efficacement les PAP du rat plus gros, offrant une disponibilité tissulaire beaucoup plus grande pour les essais en aval.
Un temps de traitement prolongé des tissus peut avoir un impact négatif sur la viabilité des PAF. Si plusieurs échantillons sont traités simultanément, il est recommandé que deux opérateurs exécutent le protocole en tandem pour maximiser la viabilité des cellules isolées. Commencez par placer le tissu musculaire récolté dans un plat de culture cellulaire stérile de 10 centimètres.
Déchirez doucement et hachez le tissu avec une pince et retirez le tissu conjonctif pour obtenir des morceaux cubiques d’environ trois à quatre millimètres. Transférer le tissu minster dans un tube conique stérile de 50 millilitres contenant six millilitres de DMEM et 1% de pénicilline-streptomycine. Ensuite, activez 365 microlitres de solution de collagénase II en ajoutant 10 microlitres de solution de chlorure de calcium de 300 millimolaires.
Ajouter la solution de collagénase II activée à la boue tissulaire pour une concentration finale de 250 unités par millilitre. Incuber les tubes dans un shaker pendant une heure et à 37 degrés Celsius à 240 x g avec agitation manuelle toutes les 15 minutes pour déloger le tissu collé sur le côté du tube. Après une heure d’incubation, ajouter 100 microlitres de collagénase II et 50 microlitres de dispase à l’échantillon.
Ensuite, pipette échantillonne 15 à 20 fois avec une pipette sérologique jusqu’à ce que la solution soit homogène. Incuber à nouveau l’échantillon pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 240 x g avec agitation manuelle toutes les 15 minutes. Cisaillez lentement les échantillons de solution musculaire à travers une seringue de 20 millilitres avec une aiguille de calibre 20 pendant 10 cycles.
Ensuite, placez une passoire cellulaire de 40 microns sur un tube conique stérile de 50 millilitres et mouillez-la en pipetant cinq millilitres de DMEM complétés par 10% FBS et 1% de pénicilline-streptomycine. Pipeter l’échantillon un millilitre à la fois à travers la passoire. Une fois l’échantillon entier filtré, laver la passoire cellulaire avec du DMEM complété par 10% FBS et 1% de pénicilline-streptomycine pour porter le volume total de l’échantillon à 25 millilitres.
Divisez le volume de l’échantillon également en deux tubes coniques de 15 millilitres et centrifugez à 15 degrés Celsius, 400 x g pendant 15 minutes. Après centrifugation, aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse RBC à température ambiante pendant sept minutes. Ensuite, ajoutez neuf millilitres de tampon de lavage pour porter le volume à 10 millilitres et centrifugez à 15 degrés Celsius, 400 x g pendant 15 minutes.
Après centrifugation, aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lavage. Transférer un volume approprié de cellules dans un tube de microcentrifugation séparé de 1,5 millilitre et mélanger avec un colorant bleu trypan. Comptez les cellules vivantes au microscope optique à l’aide d’un hémocytomètre.
Pour la cytométrie en flux, transférer une à 2 millions de cellules par échantillon expérimental dans un tube de microcentrifuge stérile de 1,5 millilitre. Porter le volume de l’échantillon à un millilitre avec un tampon de lavage et placer le tube sur de la glace. Configurez tous les contrôles de l’expérience.
Pour les contrôles cellulaires, aliquote 500 000 à 1 million de cellules dans un millilitre de tampon de lavage dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et placez-le sur de la glace. Si l’expérience est réalisée pour la première fois, des suspensions cellulaires à coloration unique doivent également être incluses. Pour mettre en place des contrôles de perles, ajoutez environ 150 000 perles de compensation positive à chaque tube de centrifugeuse étiqueté de 1,5 millilitre.
Préparer le contrôle de la viabilité en transférant la moitié du volume cellulaire du tube de viabilité pour rafraîchir le tube de microcentrifuge de 1,5 millilitre marqué mort. Incuber le tube mort à 65 degrés Celsius pendant deux à trois minutes, puis placez-le sur de la glace. Après l’incubation, ramener les cellules mortes dans le tube de viabilité.
Centrifuger les suspensions unicellulaires, y compris les échantillons expérimentaux et de contrôle à 500 x g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 100 microlitres de tampon de lavage après avoir aspiré le surnageant. Ajouter les anticorps selon les conditions de contrôle ou expérimentales, et faire glisser doucement l’échantillon pour assurer un mélange complet. Ensuite, incubez-les sur de la glace dans l’obscurité pendant 15 minutes.
Pour les perles de compensation, incuber le tube à température ambiante dans l’obscurité pendant 15 minutes. Porter le volume de chaque échantillon à un millilitre en ajoutant 900 microlitres de tampon de lavage à la suspension à cellule unique et 900 microlitres de PBS pour les contrôles de perles de compensation. Centrifugez les suspensions monocellulaires à 500 x g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, et les contrôles de perles de compensation à 300 x g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Après centrifugation des échantillons, aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 300 microlitres de tampon de lavage, et les contrôles de perles dans 300 microlitres de PBS et 150 000 perles de compensation négative. Conservez les échantillons de cellules sur de la glace et des échantillons de billes à température ambiante sous du papier d’aluminium. Procéder à l’acquisition de cytométrie en flux en mettant en place la stratégie de contrôle pour identifier les progéniteurs fibro-adipogéniques et les progéniteurs myogéniques.
Dans l’analyse représentative, la conjugaison réussie de l’anticorps Sca-1 APC avec une coloration unique des billes de compensation et des suspensions cellulaires générées par le muscle gastrocnémien sain du rat a été confirmée. Cinq concentrations différentes de Sca-1 APC ont été titrées sur des suspensions unicellulaires, et la concentration optimale d’anticorps a été identifiée en fonction de la plus grande intensité de fluorescence avec une coloration de fond minimale. L’identification cytométrique en flux des PAP et des MP chez les gastrocnémiens de rat a été réalisée à l’aide de la stratégie de contrôle présentée ici.
Les échantillons ont d’abord été fermés pour exclure les débris dans le comptage des perles. Les cellules ont ensuite été fermées pour exclure les doublets par les caractéristiques de dispersion frontale et latérale. La viabilité des cellules résultantes a été évaluée par coloration avec SYTOX Blue.
Les singlets négatifs SYTOX Blue ont été évalués pour CD31 et CD45 afin d’exclure les fractions Lin+. La population de Lin a été évaluée. Les cellules qui étaient positives pour Sca-1 ont été désignées FAPs, et les cellules qui étaient positives pour VCAM-1 ont été désignées MPs.
Avec la co-immunocoloration immédiatement après le tri, la population fraîchement isolée de FAP a montré une coloration positive pour PDGFRalpha sans contamination par des cellules Pax7 positives. Inversement, la population triée de députés s’est avérée positive pour Pax7 avec une absence de cellules PDGFRalpha-positives. Les PAF ont démontré des fibroblastes et des adipocytes différenciés au jour 12 dans des milieux de différenciation adipogène avec expression de la protéine 1 spécifique des fibroblastes et de la périlipine 1, respectivement.
La présence de triglycérides et de lipides neutres provenant d’adipocytes matures était évidente avec la coloration à l’huile rouge O. De plus, les PAP ont démontré une présence de collagène de type I et une absence de myocytes contaminants. Les députés cultivés dans des milieux de différenciation myogénique au jour 12 présentaient la présence de myocytes matures et de myotubes multinucléés fusionnés, et étaient exempts de fibroblastes et de contamination adipocytaire.
Lorsqu’ils utilisent cette technique pour isoler des cellules vivantes en vue d’une culture à long terme, les chercheurs doivent s’assurer d’utiliser une technique aseptique tout en travaillant efficacement pour assurer une bonne viabilité cellulaire.
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