Biology
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使用刺激拉曼散射显微镜对 卡诺哈布迪炎电子人 中的脂质存储动力学进行无标签成像
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Summary May 28th, 2021
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刺激拉曼散射（SRS）显微镜允许选择性，无标签成像的特定化学莫伊蒂，它已被有效地用于图像脂质分子在体内。在这里，我们简要介绍了SRS显微镜原理，并描述了用于 在卡诺哈布迪炎电子群中成像脂质储存的方法。
Transcript
刺激拉曼散射显微镜是一种化学成像技术，能够快速和定量地检测脂质，并允许以无标签的方式跟踪活体动物中的脂质。SRS显微镜比传统脂质检测技术最重要的优点是，它无标签，因此，与其他荧光和染色物质一样，照片漂白不可持续。使用SRS显微镜与可用于模型生物体的遗传和生化工具相结合，特别是卡诺哈布迪炎电子人，为研究脂质生物学和新陈代谢的正常调节器提供了一个强有力的框架。
要将激光束送入 SRS 显微镜，首先，设置潜望镜，将光束从皮秒光源出口提升到显微镜扫描仪上的红外激光输入端口，并打开激光控制软件启动激光。将泵激光功率降低到 50 毫瓦，并将泵信号设置为 750 纳米。使用光束膨胀器调整光束直径，以适应显微镜目标的后孔径。
使用两个继电器镜，M1和M2，引导激光束到潜望镜，并将潜望镜的点头设置在调谐范围的中心。选择每个镜的初始位置和角度，使激光束大致击中镜中中心，将光束发射到显微镜中，并在显微镜的客观炮塔上使用空端口执行路线对齐。将功率计探头放置在目标端口，以测量传输光的功率，并将显微镜扫描仪设置为最高变焦 50 倍。
用聚焦激光束点测量传输光的功率，并反复优化反射镜 M1 和 M2 的旋钮，实现最高的传输激光功率。使用对齐工具执行传输光的精细对齐，以确保光线通过目标中心，并将荧光目标对齐盖放在空目标座椅上。调整第一个转向镜 M1 的旋钮，以激光束点为中心，并将另一端的扩展管与对齐帽引入空目标座椅，用于监控激光束点。
然后，调整第二个转向镜 M2 的旋钮，再次将激光束点中心放在扩展管的另一端。要设置 SRS 检测模块，请在凝结器后放置一个光束分流器立方体，将传输的激光引导到照片二极管模块。要设置电子连接，请在 picosed 可调谐激光器内使用 20 兆赫的内置电光调节器来调节斯托克斯光束的强度，并将照片二极管的输出信号输入锁定放大器，以降解刺激的 Raman 损失。
然后，将锁定放大器输出输入显微镜的模拟盒，将电模拟信号转换为数字信号。为了优化成像条件，在迷你显微镜滑动室中加入五微升油酸，并盖上盖片覆盖样品。将样品放在显微镜阶段，并使用垫的边缘定位并聚焦于液滴。
调整凝结器以进行科勒照明，并使用红外传感器卡和红外查看器检查泵束路径是否仍然正确。确认延迟阶段设置为零股骨秒，并将泵束波长设置为 795.8 纳米。将泵束的功率设置为 50 毫瓦，并将斯托克光束设置为 100 毫瓦。
打开光束的快门以及激光的主快门。扫描样本并检查计算机屏幕上的图像。将显示模式更改为高低，并调整范围以查看大约 50% 的饱和度。
检查饱和度是否以图像为中心，仔细调整 picosed 可调谐激光系统内的转向镜，以优化泵和斯托克斯的重叠，以最大限度地提高图像强度，并在必要时将峰值强度集中。每次成像会话之前，在带两层实验室胶带的支撑滑梯之间放置的干净玻璃滑梯上加入 100 微升的暖 2%agarose，并迅速将第二张幻灯片放在第一张幻灯片的顶部。轻轻按下，创建一个薄，均匀，蔗糖垫，让阿加罗斯冷却。
要安装蠕虫进行成像，请将每 10 到 20 种蠕虫的麻醉剂滴 4 到 5 微升放在盖片上，然后使用解剖显微镜挑选要成像的蠕虫，将蠕虫放在麻醉液滴上收集。当所有的蠕虫都收集起来时，用玻璃滑梯用糖垫盖住蠕虫。用于成像，将蠕虫样本与盖片对面对着目标透镜，并将明亮的场光源引导到目镜中以定位蠕虫。
将蠕虫集中到焦点中，并相应地调整凝结器位置。通过将泵激光功率设置为 200 毫瓦，将 IR 功率设置为 400 毫瓦来调整激光功率。设置锁定放大器，以演示蠕虫 SRS 信号。
开始以快速扫描速率扫描第一个蠕虫，调整精细对焦以找到感兴趣的区域。优化信号后，切换到较慢的扫描速率和更高的像素分辨率，以获取 SRS 图像并以能够实现高分辨率的格式保存图像。当所有样品都成像后，将激光源置于待机状态，并关闭所有相关设备。
要分析图像，请打开 ImageJ 中的文件，然后选择分析并设置测量结果，以选择要分析的属性。使用多边形选择工具勾勒出蠕虫肠道的区域进行量化，然后单击分析并再次测量。测量结果将显示在结果窗口中。
当所有蠕虫都已勾勒出来时，将给定基因型中每个蠕虫的测量结果复制并粘贴到电子表格中。对于背景测量值，选择没有任何 SRS 信号的蠕虫附近区域，并从每个蠕虫的测量中减去背景平均灰色值，以计算背景的平均和标准偏差减去给定基因型或测试组中所有蠕虫的平均和标准偏差。然后，这些值可以标准化到对照组的平均值。
在这项具有代表性的分析中，在成年期间对年龄同步的野生型蠕虫和缺乏胰岛素受体的daf-2突变体的肠道脂质水平进行了量化。不出所料，野生类型蠕虫的脂质水平下降，从第一天开始，一直持续到成年后的第九天。然而，daf-2突变体的脂质水平增加，直到它们五天大，此时它们保持恒定，比野生类型高2.5至3倍。
Daf-16灭活抑制了dab-2突变体脂质水平的增加。daf-16a a 或 daf-16b 等形在 daf-2 中的表达，daf-16 双突变体不能恢复脂质水平。然而，daf-16d/f/h等形的表达足以将 daf-2、daf-16 双突变体中的脂质水平恢复到 daf-2 单突变体中观察到的水平。
这些结果表明，daf-16d/f/h等形体特别调节了dab-2突变蠕虫中的脂质代谢。在整个成像过程中，使用相同的激光功率用于泵和斯托克斯光束，并且每六和四次一致的量化中包括一个对照组，这一点很重要。除了量化脂质储存外，SRS显微镜还可以与生物动脉标记（如宫内膜）相结合，并实现脂质结合、合成和降解的动态可视化。
SRS显微镜允许多路复用，可实现在不同的子细胞隔间中对多个生物分子进行成像。所谓的超光谱SRS显微镜在探索代谢动力学方面有着美好的未来。
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