Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Time-Resolved Флуоресценция Изображения и анализ вторжения раковых клеток в 3D-модель сфероидов
Chapters
Summary January 30th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь представлен протокол по изготовлению сфероидного устройства визуализации. Это устройство позволяет динамические или продольные флуоресценции изображения сфероидов раковых клеток. Протокол также предлагает простую процедуру обработки изображений для анализа вторжения раковых клеток.
Transcript
Этот протокол может быть использован для изучения механизмов, регулирующих вторжение раковых клеток во внеклеточную матрицу в режиме реального времени. Основным преимуществом этой техники является то, что он использует простое устройство сфероидной визуализации, что делает анализ нашествия сфероидов легче настроить и повышает его эффективность и стоимость. В то время как мы демонстрируем использование сфероидной нашествия анализ для моделирования молочной карциномы, этот анализ является отличной моделью для вторжения любой твердой опухоли в окружающие здоровые ткани.
После 3D-печати спейсера, вес из 10:1 соотношение базового полимера к кросс-linker в пластиковый стаканчик и использовать одноразовые пипетки тщательно перемешать в результате PDMS решение в чашке. Поместите чашку в вакуумную камеру и быстро отпустите вакуумное давление, чтобы удалить любой воздух, захваченный на поверхности смеси и рассеять оставшиеся пузырьки воздуха. Инкубировать 3D печатный спейсер при 100 градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы увеличить свою гибкость и очистить две стеклянные пластины со 100%изопропанолом.
Поместите пространство так, что это заподлицо между двумя очищенными пластинами и поместите два больших зажима связующего на нижнем краю и один на верхний угол, чтобы запечатать плесень на внешние края пластин. Осмотрите верхнюю часть формы, чтобы убедиться, что спейсер заподлицо со стеклянными пластинами и использовать одноразовые пипетки с примерно два сантиметра вырезать из кончика медленно, но постоянно добавлять смесь PDMS в левый верхний угол формы. Когда вся плесень была заполнена, поместите плесень в вакуумную камеру, чтобы удалить любые пузырьки воздуха, которые сформировались, прежде чем лечить PDMS в течение одного часа при 100 градусах по Цельсию.
В конце инкубации поместите форму при комнатной температуре. Когда это прохладно на ощупь, удалить связующие клипы и стеклянные пластины из спейсера, содержащего вылечить PDMS и использовать лезвие бритвы, чтобы прорезать печать, которая была создана на всех четырех сторонах формы между спейсером и стеклянной пластины. Потяните друг от друга плесень, чтобы выявить лист PDMS в spacer и использовать пинцет, чтобы тщательно очистить лист PDMS от спейсера.
Поместите лист на режущей коврик и используйте пунш биопсии, чтобы пробить диск PDMS диаметром 17,5 миллиметра, а затем пробить три равномерно распределенных отверстия 5,5 миллиметра в диск. Используйте ленту, чтобы удалить частицы пыли из каждой вставки и придерживаться очищенных вставок на кусок односторонней ленты. Оберните ленту вокруг крышки 10-сантиметровой чашки Петри и поместите крышку в плазменную машину вместе с открытыми 35-миллиметровыми стеклянными нижней посудой.
Активируйте вставки и стекло с одной минутой плазменной обработки на 300 миллиторов и используйте пинцет, чтобы быстро прикрепить обработанную сторону каждой вставки к стеклянной части одной обработанной стеклянной нижней тарелки на вставку. Когда все вставки были применены, используйте указательный палец и большой палец, чтобы применить равномерное давление на каждую вставку во время вращения блюда, чтобы надежно прикрепить вставки к посуде. Когда все вставки были защищены, инкубировать в результате сфероидных изображений устройств в течение 20 минут при 60 градусов по Цельсию, прежде чем выполнять второй раунд плазмы лечения, как показано.
После второй обработки добавьте 35 микролитров свежеприготовленного раствора покрытия к каждому отверстию вставки. После одного часа при комнатной температуре снимите раствор покрытия и трижды промойте устройство дистиллированной водой. После последней стирки добавьте 35 микролитров кросс-связывающего раствора в каждое отверстие для 30-минутной инкубации при комнатной температуре.
В конце инкубации, промыть устройство три раза дистиллированной водой, как попродемонстрировано, прежде чем заполнить каждое устройство с 70% этанола для 30-минутной инкубации под ультрафиолетовым светом. В конце стерилизации, промыть устройства три раза дистиллированной водой и добавить 2,5 миллилитров раствора для хранения для каждого устройства. Чтобы встроить сфероиды в коллаген, мыть устройства три раза с тремя миллилитров PBS за стирку.
После последней стирки, дайте устройствам полностью высохнуть, прежде чем добавить один сфероид в 30 микролитров свежеприготовленного колледжа один раствор в одно отверстие вставки и запуск таймера. Подтвердив наличие сфероида в отверстии, добавьте сфероиды к двум другим отверстиям, как это было продемонстрировано. Используйте 10 микролитр пипетки отзыв для последние любые сфероиды, которые расположены близко к границе PDMS, или отделить сфероиды, если несколько сфероидов распределяются и остановить таймер.
Чтобы вертикально центрировать сфероид в коллагеновом слое, после посева переверните устройство вверх дном и инкубируйте устройство при 37 градусах до тех пор, пока коллаген не полимеризируется, обратив ориентацию устройства каждые две минуты в общей сложности на 30 минут, затем добавьте 2,5 миллилитров среднего на устройство и приобретете изображение сфероидов в точке нулевого часового времени. Использование сфероидного изображения устройства облегчает эффективное встраивание и промежуток времени записи вторжения раковых клеток в коллагене или с помощью продольной визуализации. Хотя этот сфероид был изображен продольно в течение шести дней, требующих стабильного выражения цитоплазмических и / или ядерных флуоресцентных белков, аналогичные продольные изображения могут быть выполнены в течение более короткого периода времени с использованием красителя маркировки.
Сфероиды также могут быть исправлены и immunolabeled. Например, эти сфероиды были иммунолабелированы для эпителиально-кадерин, кортактин, и F-актин. На этих снимках можно наблюдать пошаговую иллюстрацию процедуры обработки изображений с использованием макроса Фиджи для измерения области сфероида с течением времени.
Обязательно раздай один сфероид в каждое отверстие сфероидного устройства визуализации и распоистит сфероид в центре отверстия в обоих направлениях XY и q. Конструкция устройства может быть легко изменена путем изменения размера и расположения отверстий, вставок и стеклянной нижней посуды для размещения более высокой пропускной способности сфероида.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
