Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Электрокортикографическая запись областей коры головного мозга, манипулируемых с использованием аденоассоциированного вируса, нацеленного на кофилин у мышей
Chapters
Summary February 21st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
В данной статье описан протокол манипуляции молекулярными мишенями в коре головного мозга с использованием аденоассоциированных вирусов и для мониторинга последствий этой манипуляции во время бодрствования и сна с помощью электрокортикографических записей.
Transcript
Этот протокол может быть использован для выявления роли конкретных отдельных молекулярных мишеней в регуляции электрокортикографической активности при различных вигилиновых состояниях. Среди преимуществ использования аденоациированного вируса — способность точно нацеливаться на данную область мозга и определенный тип клеток. Демонстрировать протокол будет Жюльен Дюфор-Жерве, научный сотрудник моей команды.
После подтверждения отсутствия реакции на рефлекс защемления ног у анестезируемой 12-недельной мыши, используйте триммер для волос, чтобы сбрить волосы от задней части ушей до передней части головы между глазами. Добавьте щедрую каплю офтальмологической мази на каждый глаз, чтобы предотвратить обезвоживание, и используйте ушные вкладыши, чтобы аккуратно закрепить головку мыши на стереотаксическом аппарате. Осторожно вытяните язык изо рта, чтобы избежать удушья.
Закрепите нос мыши к аппарату и используйте 70% этанол для стерилизации открытой кожи на голове. Удерживая кожу сверхтонкими щипцами Graefe, используйте тканевые ножницы, чтобы разрезать кожу от основания ушей до уровня глаз и поместите два хирургических зажима на каждую сторону разреза, чтобы растянуть кожу и обнажить череп. Избегая мозговых швов, используйте наконечник ножниц, чтобы поцарапать поверхность черепа, чтобы удалить надкостницу и создать перекрывающиеся полосы в двух или более направлениях.
Используйте 70% этанол для удаления фрагментов костей и дезинфекции черепа. С помощью предварительно подготовленной канюли, прикрепленной к стереотаксическому плечу, определите местоположение брегмы и лямбды и запишите стереотаксические координаты каждого из них. Используйте стереотаксическую руку и ручку, чтобы отметить положение канюли на черепе 1,5 миллиметра латерально справа от средней линии и 1,5 миллиметра с передней стороны до брегмы.
Используя 0,7-миллиметровое сверло, аккуратно проткните череп в отмеченном положении перпендикулярно поверхности черепа и выровняйте вертикальную ось и промойте череп стерильным хлопковым наконечником, пропитанным 10%-ным раствором бетадина повидона йода, затем втягивайте поршень 10-микролитрового шприца на один микролитр, чтобы загрузить канюлю одним микролитром воздушного пузыря. Затем смешайте интересующую смесь AAV с медленным пипетированием и добавьте 1,7 микролитра смеси в стерильную чашку Петри. С помощью этого шприца загрузите 1,5 микролитра раствора в канюлю и отметьте положение пузырька воздуха на подключенной трубке PE50.
Вертикально выровняйте канюлю с отверстием в черепе так, чтобы канюля достигла верхнего края кости и отметьте Z-координату поверхности черепа. Медленно опустите канюлю, пока кончик не достигнет 1,5 миллиметра ниже поверхности черепа и пятого слоя моторной коры и запустите шприцевую насос со скоростью потока 0,025 микролитра в минуту, чтобы доставить один микролитр AAV в течение 40 минут. Используйте воздушный пузырь в трубке для отслеживания впрыска, внося необходимые коррективы.
Когда весь объем вируса будет доставлен, оставьте канюлю на месте в течение пяти минут, чтобы обеспечить достаточную диффузию и избежать обратного потока, прежде чем медленно и осторожно поднимать стереотаксическую руку, чтобы удалить канюлю из коры. Для имплантации электрода используйте прямые щипцы Келли, чтобы медленно вкрутить один электрокортикографический электрод с прямой золотой проволокой в вертикальную ось отверстия, в которое был введен AAV, оставив не менее 2,5 миллиметров винта за пределами черепа, чтобы свести к минимуму повреждение твердой мозговой оболочки и коры головного мозга. Используйте перо для обозначения положения опорного электрода 2,6 мм поперечно справа от средней линии и 0,7 миллиметра с задней стороны до брегмы и положения заднего электрокардиографического электрода на 1,5 миллиметра латерально справа от средней линии и 1,5 миллиметра к передней части к лямбде и положения трех шнеков обслуживания на левом полушарии без конкретных координат, но как можно более удаленными друг от друга и от электрокортикографических электродов.
Используйте дрель, чтобы аккуратно проткнуть череп перпендикулярно поверхности черепа в отмеченных положениях других электродов и винтов и промыть проколотый череп 10%-ным раствором повидона йода. Заблокируйте отверстия небольшими свернутыми кусочками деликатной задачи протрите перед установкой винтов, чтобы предотвратить кровотечение и загрязнение, и используйте прямые щипцы Келли, чтобы вставить винты в отверстия сверла под тем же углом, под которым были пробиты отверстия. Поместите несколько небольших капель зубного цемента в центр кольцеобразного пространства внутри винтов и используйте сверхтонкие щипцы Graefe, чтобы поднять кожу над мышцами шеи.
Используя щипцы Дюмона номер пять, удерживайте изогнутую конечность одного электромиографического электрода и вставляйте его примерно на один-два миллиметра в мышцы. Поместите изогнутую сторону и точку складывания электрода в зубной цемент и вставьте второй электромиографический электрод таким же образом. После покрытия глаз животного нанесите свет на три-пять минут, чтобы затвердеть цемент и используйте дополнительный зубной цемент для покрытия основания электрокортикографических электродов и анкерных винтов для формирования короновидного контура.
После нанесения еще трех-пяти минут света заполните центр монтажа акриловым цементом и снимите хирургические зажимы. Используйте синтетический рассасывающиеся монофиламентные швы, чтобы закрыть кожу спереди и сзади монтажа, чтобы череп не подвергался воздействию, и используйте изогнутые щипцы, чтобы удерживать разъем над монтажом, чтобы аккуратно выровнять золотые провода электродов с контактами разъема, а затем быстро припаять каждую оконечность электрода к одному соответствующему контакту разъема. После снятия мыши с рамы закройте пустое пространство между разъемом и головкой акриловым цементом.
А после взвешивания поместите мышь в чистую клетку с несетчатой крышкой на грелке. Через две недели после операции подключите мышей к регистрируемым кабелям и, по крайней мере, через неделю записывайте электрокортикографические и электромиографические сигналы в течение 24 часов или более. Успешная инфекция подтверждается окрашиванием ГК нейронов в моторной коре, окружающей место инъекции, что указывает на наличие кофилина S3D HA. Совместное окрашивание с возбуждающим нейронным маркером CaMKII alpha указывает на четкую кофилиновую кофилин S3D HA и CaMKII альфа-коэкспрессию при высоком увеличении.
Логарифмические преобразованные относительные спектры мощности для бодрствования, медленного волнового сна и парадоксального сна показывают специфические для состояния различия в спектральной активности при инактивации кофилина. Комбинация электрокортикографической записи и AAV-опосредований манипуляций точными молекулярными мишенями также применима к нескольким областям мозга и к другим подполям нейробиологии, таким как исследования эпилепсии или памяти в дополнение ко сну.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
