Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Elektrokortografisk optagelse af cerebral cortex-områder manipuleret ved hjælp af en Adeno-associeret virus, der er målrettet cofilin hos mus
Chapters
Summary February 21st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne artikel beskriver en protokol for manipulation af molekylære mål i hjernebarken ved hjælp af adeno-associerede vira og til overvågning af virkningerne af denne manipulation under vågenhed og søvn ved hjælp af elektrokorttiske optagelser.
Transcript
Denne protokol kan bruges til at identificere specifikke individuelle molekylære måls rolle i reguleringen af elektrokortografisk aktivitet under forskellige Vigilin-tilstande. Blandt fordelene ved at bruge adeno-associeret virus er evnen til præcist at målrette en given hjerneregion og en bestemt celletype. Julien Dufort-Gervais, en forskningsmedarbejder fra mit team, demonstrerer protokollen.
Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids refleks i en bedøvet 12-ugers gammel mus, skal du bruge en hår trimmer til at barbere håret fra bagsiden af ørerne til forsiden af hovedet mellem øjnene. Tilsæt en generøs dråbe oftalmisk salve til hvert øje for at forhindre dehydrering og brug ørestængerne til omhyggeligt at fastgøre musens hoved på et stereotaxisk apparat. Træk forsigtigt tungen ud af munden for at undgå kvælning.
Fastgør musens næse til apparatet og brug 70% ethanol til at sterilisere den udsatte hud på hovedet. Hold huden med ekstra fine Graefe pincet, bruge væv saks til at skære huden fra bunden af ørerne til niveauet af øjnene og placere to kirurgiske klemmer på hver side af snittet til at strække huden og til at udsætte kraniet. Undgå hjerne suturer, skal du bruge en saks spids til at ridse kraniet overfladen for at fjerne periosteum og til at skabe overlappende striber i to eller flere retninger.
Brug 70% ethanol til at fjerne knoglefragmenterne og desinficere kraniet. Med en tidligere forberedt kanyle fastgjort til den stereotaxiske arm, identificere placeringen af bregma og lambda og bemærk stereotaxic koordinater af hver. Brug den stereotaxiske arm og en pen til at markere kanylens position på kraniet 1,5 millimeter sideværts lige til midterlinjen og 1,5 millimeter foran bregmaen.
Ved hjælp af en 0,7 millimeter borebit, forsigtigt gennembore kraniet på den markerede position vinkelret på kraniets overflade og afstemt med den lodrette akse og vask kraniet med en steril bomuldsspids gennemblødt i en 10% betadine povidone jodopløsning, og træk derefter stemplet af en 10 mikroliter sprøjte af en mikroliter for at indlæse kanylen med en mikroliter luftboble. Bland derefter AAV-blandingen af interesse med langsom pipering og tilsæt 1,7 mikroliter af blandingen til en steril petriskål. Brug denne sprøjte til at indlæse 1,5 mikroliter af opløsningen i kanylen og markere luftboblens position på det tilsluttede PE50-rør.
Lodret justere kanylen med hullet i kraniet, således at kanylen når den øverste kant af knoglen og markere Z-koordinaten af kraniets overflade. Sænk langsomt kanylen, indtil spidsen når 1,5 millimeter under kraniets overflade og lag fem af den motoriske cortex og start sprøjtepumpen med en 0,025 mikroliter pr. Minut flowhastighed for at levere en mikroliter AAV over 40 minutter. Brug luftboblen i røret til at spore injektionen, og foretag eventuelle justeringer efter behov.
Når hele virusvolumen er blevet leveret, skal du lade kanylen være på plads i fem minutter for at sikre en tilstrækkelig diffusion og for at undgå tilbagestrømning, før du langsomt og forsigtigt løfter den stereotaxiske arm for at fjerne kanylen fra cortex. Til elektrodeimplantation skal du bruge lige Kelly-pincet til langsomt at skrue en elektrocorticografisk elektrode med en lige guldtråd ind i den lodrette akse i hullet, hvor AAV blev injiceret, hvilket efterlader mindst 2,5 millimeter skrue uden for kraniet for at minimere skaderne på duraen og hjernebarken. Brug en pen til at markere placeringen af referenceelektroden 2,6 millimeter sideværts til midterlinjen og 0,7 millimeter posterior til bregma og placeringen af den bageste elektrokardiografiske elektrode ved 1,5 millimeter sideværts lige til midterlinjen og 1,5 millimeter foran lambda og placeringen af tre vedligeholdelsesskruer på venstre halvkugle uden specifikke koordinater, men så fjernt som muligt fra hinanden og fra de elektrokortografiske elektroder.
Brug boret til forsigtigt at gennembore kraniet vinkelret på kraniets overflade på de markerede positioner af de andre elektroder og skruer og vask det gennemborede kranium med en 10%povidone jodopløsning. Bloker hullerne med små rullede stykker delikat opgavetørring, før du installerer skruerne for at forhindre blødning og forurening, og brug lige Kelly-tang til at indsætte skruerne i borehullerne i samme vinkel, som hullerne blev gennemboret. Placer et par små dråber dental cement i midten af ringen-lignende rum inde i skruerne og bruge ekstra fine Graefe pincet til at løfte huden over nakkemusklerne.
Brug Dumont nummer fem pincet, hold den buede ekstremitet af en elektromyografisk elektrode og indsætte det cirka en til to millimeter i musklerne. Placer elektrodens buede side og foldepunkt i tandcementen, og indsæt den anden elektromyografiske elektrode på samme måde. Efter at have dækket dyrets øjne, skal du anvende lys i tre til fem minutter for at størkne cementen og bruge yderligere dentalcement til at dække bunden af de elektrokortografiske elektroder og ankerskruerne til at danne en kroneformet kontur.
Efter påføring af tre til fem minutters lys mere, fyld midten af montagen med akrylcement og fjern de kirurgiske klemmer. Brug en syntetisk absorberbar monofilamenter sutur til at lukke huden på forsiden og bagsiden af montagen, så kraniet ikke er udsat og bruge buede pincet til at holde stikket over montagen til omhyggeligt at tilpasse guldtråde af elektroderne med stikket stifter, derefter hurtigt lodde hver elektrode ekstremitet til en enkelt tilsvarende stik pin. Når du har fjernet musen fra rammen, skal du dække det tomme mellemrum mellem stikket og hovedet med akrylcementen.
Og efter vejning skal du placere musen i et rent bur med et ikke-maskeret låg på en varmepude. To uger efter operationen skal musene forbindes til optagelseskabler, og mindst en uge senere registreres de elektrokortografiske og elektromyografiske signaler i 24 timer eller mere. En vellykket infektion bekræftes af HA farvning af neuronerne i den motoriske cortex omkring injektionsstedet, hvilket indikerer tilstedeværelsen af cofilin S3D HA. Co-farvning med excitatoriske neuron markør CaMKII alpha angiver klar cofilin S3D HA og CaMKII alpha co-udtryk under høj forstørrelse.
Log forvandlet relative magt spektre for vågenhed, langsom bølge søvn, og paradoksale søvn viser statsspecifikke forskelle i spektral aktivitet under cofilin inaktivering. Kombinationen af elektrokortografisk optagelse og AAV-medieret manipulation af præcise molekylære mål gælder også for flere hjerneregioner og for andre neurovidenskabsunderfelter såsom forskning i epilepsi eller hukommelse ud over søvn.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
