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質量分析によるタンパク質高次構造の研究のためのジエチルピロカーボネートとの共有結合標識
Summary June 15th, 2021
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質量分析検出を用いてジエチルピロカーボネートベースの共有標識を行うための実験的手順について説明する。ジエチルピロカーボネートは、単に目的のタンパク質またはタンパク質複合体と混合され、溶媒にアクセス可能なアミノ酸残基の修飾につながる。修飾残基は、タンパク質分解と液体クロマトグラフィー/質量分析分析の後に同定することができる。
Transcript
タンパク質構造の特徴付けは、その機能を理解するために不可欠です。質量分析は、特に従来の方法では研究が困難なタンパク質系に対して、この目的のための強力なツールとして登場しました。質量スペックによるタンパク質構造の研究のために、タンパク質構造情報をその質量にコードする溶液中で特定の化学反応が行われる。
特に効果的なアプローチの1つは、共有化して、解析可能なアミノ酸側鎖を修飾する試薬を使用することです。これらの反応は、タンパク質分解性消化およびタンデム質量分析と組み合わせると残留レベル分解能に局在化できる質量増加を招く。ここでは、質量スペック検出と共に共有標識試薬としてのジエチルパイロカーボネートまたはDEPCの使用に関連するプロトコルについて説明した。
DEPCは、平均タンパク質中の残基の30%まで標識することができる高い電気電子分子であり、それにより、優れた構造分解能を提供する。DEPCは、多くの異なるタンパク質の構造情報を得るためにマススペックと一緒にうまく使用されています。まず、目的のタンパク質の緩衝溶液を数十マイクロモルの範囲の濃度で調製します。
我々は一般的に10ミリモルpH 7.4 MOPSバッファーを使用しています。あるいは、既存のタンパク質溶液は、元のサンプルが求核官能基を有する緩衝液を含む場合にMOPSまたは別のバッファーへのバッファー交換をすることができる。彼らはDEPCタンパク質反応を妨げるので、バッファーは、求核機能基を有しないことが必要です.
別のマイクロチューブでは、乾燥アセトニトリルに100ミリモルDEPCのストック溶液を調製する。乾燥アセトニトリルでストック溶液を調製することは、DEPCの加水分解を防ぐために必要である。新しいマイクロチューブで、HPLCグレードの水に1モルイミダゾールの溶液を調製します。
新しいマイクロチューブで、MOPSバッファーとタンパク質溶液を混合します。タンパク質とバッファーにDEPCストック溶液のアリコートを追加し、反応混合物を37°Cの水浴に1分間入れる前に適切に混合していることを確認します。使用されるDEPCストック溶液の体積は、望ましい最終的なDEPCタンパク質濃度比に基づいて選択されるべきである。
すべてのタンパク質で動作するDEPCとタンパク質濃度のセットはありませんが、最適なDEPC濃度は、タンパク質に存在する溶媒アクセス可能なヒスチジンおよびリジン残基の数に基づいて推定することができます。なお、アセトニトリル添加の体積は、効果的に添加されるDEPC溶液の体積が、反応中のタンパク質構造の摂動を避けるために全反応量の1%を超えてはならないことに留意すべきである。反応時間は最終的にユーザ次第であるが、例の条件下での1分間の反応は、DEPCのタンパク質の標識および加水分解を最小限に抑える。
1分経過した後、反応したDEPC上で残りのを清掃するためにイミダゾールを添加することによって反応をクエンチする。イミダゾールの最終濃度がDEPC濃度の50倍であることを確認してください。DEPCによって修飾された残基を同定するために、タンパク質はタンパク質分解的にペプチド断片に消化されなければならない。
消化のために、目的のタンパク質に適した条件を選択してください。ここで説明する一般的なステップは、タンパク質を展開し、消化効率を改善できるようにジスルフィド結合を減少およびアルキル化することを含む。我々の経験では、消化前に変性剤と熱でタンパク質を展開すると、消化の効率が向上します。
タンパク質が展開されている間、適切な消化バッファー内のTCEPとヨウドアセトアミドの溶液を比較します。DTTはDEPC改変残基と反応することができるので、TCEPはジチオスレイトールまたはDTTの代わりに還元剤として使用されるべきである。還元後に得られるファイルのアルキル化は、フリーファイルとタンパク質が改変アミノ酸と反応する標識スクランブルを避けるために不可欠です。
展開ステップが完了したら、反応混合物にTCEPを加えて二硫化物結合を減らし、室温で3分間反応させます。還元後、反応混合物にヨウアドアセトアミドを加え、暗闇の中で室温で30分間反応させた。ここで、反応混合物を箱に入れることによって達成する。
ヨウドアセトアミドの最終濃度は、TCEPに使用される濃度の2倍、またはタンパク質濃度またはジスルフィド結合の80倍である必要があります。目的の酵素を準備します, 通常、メーカーの仕様に従ってトリプシンまたはキモトリプシン.選択した酵素を調製した後、消化を開始し、37°Cで反応混合物をインキュベートします。
固定化酵素を用いた3時間の消化を伴う10:1タンパク質と酵素比は、典型的にはDEPC標識タンパク質に適した選択である。消化後、試料は直ちにLC-MS/MSで分析するか、液体窒素で凍結して、サンプルの劣化と標識の損失を最小限に抑える必要があります。ボトムアッププロテオミクスの標準LC-MS/MSパラメータは、タンパク質分解ペプチド断片上の標識部位を同定するために使用することができます。
逆相C18定常相は、ペプチドの最良の分離を達成するために使用されるべきである。当社の経験では、キャピラリーLCは、使用されるサンプル量が多いため、ナノLCよりも修飾レベルに関するより信頼性の高い定量情報を提供します。DEPC標識ペプチドを分離するために使用される典型的なLC移動相は、2つの溶媒で構成される。
溶媒Aは0.1%のギ酸を含む水であり、溶媒Bは0.1%のギ酸を有するアセトニトリルである。勾配溶出が使用され、サンプルの複雑さに基づいて分離時間を最適化できます。オンラインLC-MSおよびMS/MSを行うことができる質量分析計は、ペプチド上のDEPC修飾部位を同定するために必要とされる。
我々の実験では、質量分析計のいくつかのタイプを使用することに成功しました。我々は、熱軌道融解核が優れた結果を提供することを発見したが、LC-MS分析の過程で多くのペプチドのMS/MSを自動的に行うことができる質量分析計は適切であるべきである。測定前にHPLC条件と質量分析パラメータを適切に設定する必要があります。
サンプルがフラッシュフリーズされている場合は、分析の直前に解凍する必要があります。サンプル調製とHPLC注入の間の時間を最小限に抑えるために最善を尽くしてください。LCシステムに消化された標識タンパク質サンプルをロードして注入し、LC-MS/MSの取得またはDEPCラベルサイトの同定およびピーク面積の定量を開始し、複数の方法が存在する。
サーモフィッシャーの機器では、エクスカリバーまたはプロテオームの発見者が使用される可能性があります。プログラムでペプチドの同定に適切なパラメータを設定します。DEPC付加およびカルバミドメチル化は、残基を補助または割り当てる可変的な修飾として含まれる。
ペプチドの修飾および未改変バージョンのクロマトグラフィーピーク領域は、残基レベルの修飾パーセンテージを決定するために使用される。MS検出によるDEPC標識は、タンパク質に対する高次構造変化を特徴付けるための貴重なツールでもあります。我々の研究から、DEPC共有結合標識は熱および酸化的ストレスの構造変化を受ける特定の蛋白質領域を同定できる。
この図では、ラベル付けの増加に対しては変更率の有意な変化が青色で示され、ラベル付けの増加に対して赤色が示され、有意な標識変更のない残基は淡い緑色で示されています。例えば、β-2ミクログロブリンが熱ストレスにさらされた後、標識範囲の有意な減少を受ける多くの残基は、N末端、セリン28、ヒスチジン31、セリン33、セリン55、セリン57、およびリジン58がこのタンパク質の領域がタンパク質の一方の側よりも近いことを示唆している。タンパク質が酸化ストレスにさらされた後、標識の減少を伴う異なる残基は、セリン11、ヒスチジン13、リジン19、リジン41、およびリジン94が他の場所で酸化誘導された確認変化が起こることを示す別の相のクラスターからなる。
この研究は、現在、医薬品市場で最も急速に成長している分野であるタンパク質治療薬にとって重要な意味を持っています。我々のグループからの他の研究はまた、DEPC共有標識質量スペックがストレスモノクローナル抗体治療の確認変化の部位を検出し、同定できることを示している。ご覧のように、DEPCによる共有ラベルは実験的に実装するのが簡単ですが、タンパク質に対する貴重な構造情報を提供することができます。
DEPC標識質量の質量の分析によって提供される構造分解能は、X線結晶学やNMRのような技術と比較すると控えめですが、そのサイズや結晶化能力に関係なく、ほぼすべてのタンパク質に適しています。DEPC共有バレントラベリング質量スペックは、タンパク質混合物でも作用し、細胞ライセートやhaCat細胞などの非常に複雑なサンプルタイプで動作します。このビデオを見た後、私たちはDEPCがタンパク質構造を特徴付けるための有用なツールを標識することを確信しています。
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