Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים
Chapters
Summary January 21st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופיית מוליכת היונים של בדיקה מקפיצה (HPICM), טכניקת בדיקה סריקה ללא מגע המאפשרת הדמיה ננומטרית של חבילות סטריאציליה בתאי שיער שמיעתיים חיים.
Transcript
מעשי זה יכול לעזור לנו ללמוד שינויים דינמיים של הרכיבים המבניים ננו של מכונות טרנסדוקציה חשמלית מכנית על פני השטח של חבילות סטריאציליה תא השיער. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הדמיה לשגות זמן של פני השטח של תאים חיים עם טופוגרפיה מורכבת ברזולוציה ננומטר יחיד, ומבלי ליצור מגע פיזי עם המדגם. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כמעט על כל תא חי.
בעבר התאמנו את פני השטח של קווי תאי אפיתל ריאות נגועים בווירוסים, תאי שריר, בחיידקי התמונה שלי בקרוב. בדוק את הננו-אפיפטים בתחילת כל מפגש הדמיה. לאחר ייצור ננו-צינור, בדוק אם קיימות בועות, והרכיב את הננופיט על מחזיק המיקרוסקופ של יון הגשושית.
בארבעה מיליליטר של פתרון אמבטיה לתא ולהניח את התא על בימת HPICM. הציגו את האלקטרודה הקרקעית לתמיסת האמבטיה וודאו שהמתח המופעל על הפיפטה דרך מגבר המהדק הוא אפס. לאחר הצבת המניפולטור המיקרו במיקום האנכי, הזז את הפיפטה ב- Z עד שהוא נוגע בנוזל והגדיר את מגבר היסט לאפס, לפני הוספת פלוס 100 מילבולט כדי לבדוק את זרם הפיפטה.
השתמש בדבק סיליקון כדי לחבר את תקן הכיול AFM לתא ולכסות את המדגם בארבעה מיליליטר של HBSS. השתמש בסרט דו-צדדי כדי לאבטח את התא לשלב X Y של הגדרת HPICM, וטען ננו-צינור חדש על המחזיק כפי שהודגם. לאחר בדיקת התנגדות nanopipette וקוטר, להגדיר את הזרם למגבר ננו אחד.
השתמש במניפולציה של מהדק תיקון גס כדי למקם את הננו-צינור בערך מעל מרכז תקן הכיול ולהגדיל את הנקודה שנקבעה תוך ניטור האות מהחיישן של מפעיל Z piezo על אוסצילוסקופ בזמן אמת. לאחר יצירת מחזור גישת Z יציבה שחוזרת על עצמה, להקטין את הנקודה להגדיר לערך רק מעל נקודת חוסר היציבות ולהזיז את pipette למטה במהירות של כחמישה מיקרון לשנייה, עד שהוא מגיע המדגם. הרמה התחתונה של אות מיקום Z בזמן אמת תגדל, מה שמצביע על כך שהננו-פיפט נסוג עקב חישת משטח המדגם.
בשל הרכבה לא אחידה על תקן AFM, הנקודה הגבוהה ביותר של תחום העניין עשויה להיות לא ידועה. לכן, להגדיר את המשרעת של נסיגה pipette לפחות 200 עד 500 ננומטר. דואג לא לחרוג מהגבול העליון של תנועת מפעיל Z piezo, להתחיל הדמיה ברזולוציה נמוכה.
לאחר שזוהתה הנקודה הגבוהה ביותר של המדגם באזור ההדמיה, הפחיתו את משרעת הדילוג וחזרו בה מהצינור כ-200 מיקרון לאורך ציר Z כדי למנוע התנגשות לא רצויה עם המדגם לפני העברתה למיקום X Y חדש. כאשר אזור העניין אותר, התחל הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר. להדמיית תאי שיער שמיעתיים, אבטחו היטב איבר מבודד טרי של קורטי לתא באמצעות חוט דנטלי, או פיפטות זכוכית גמישות.
השתמש בסרט דו-צדדי כדי לאבטח את התא היטב לשלב הפיזו X Y ולהעמיס ננו-צינור חדש על המחזיק כפי שהודגם. לאחר בדיקת עמידות nanopipette, להשתמש תיקון מהדק מיקרו מניפולטור כדי למקם את nanopipette מעל אזור תא השיער תוך התבוננות האיבר של צמח Corti X במיקרוסקופ הפוך. הקלט, אות המיקום הנוכחי בזמן אמת ו- Z באוסקילוסקופ כדי לבדוק אם המערכת יציבה עם נקודה מוגדרת של 0.5%6 או נמוכה יותר, ולקבוע את נקודת הסט האופטימלית ולגשת למדגם כפי שהודגם.
בצע הדמיה ברזולוציה נמוכה של המדגם כפי שהודגם באמצעות משרעת הופ של לפחות שישה עד שמונה מיקרון. אם הננו-צינור צריך לעבור למיקום X Y חדש, בטל את הפיפטה כ-500 ננומטרים כדי למנוע התנגשות עם תכונות גבוהות בתוך הרקמה וחזור על הדמיית HPICM ברזולוציה נמוכה עד לאזור העניין שבו ממוקמים תאי השיער. לאחר מכן צלם את אזור העניין ברזולוציה גבוהה יותר ב- 15 דקות או פחות.
ניתן להשתמש בפרוטוקול HPICM כדי לדמיין כל תא חי עם טופוגרפיה מורכבת, כגון חבילות תאי שיער שמיעתיים של חולדות חיות. למרות הדגמת רזולוציית X Y נמוכה יותר בהשוואה לסריקת תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים, תמונות HPICM יכולות לפתור בהצלחה את השורות השונות של סטריאוטיפיליה. הצורה של קצות סטריאוטיליה ואפילו חמשת ננומטר קטן קישורים המחברים את סטריאוטיפיליה הסמוכה.
בהתחשב באופי ללא מגע של הדמיית HPICM, הדמיה רציפה של אותה חבילת תאי שיער יכולה להתבצע במשך מספר שעות מבלי לפגוע בלכידות החבילה. שים לב כי עם נקודת קבוצה נמוכה מאוד, המערכת עשויה לפרש תנודות קטנות בזרם כמפגש עם משטח התא, מה שמוביל לרעש נקודה לבנה בתמונה. באופן דומה, משרעת הופ גדולה עשויה להגביר את התהודה לרוחב של הפיפטה, וכתוצאה מכך גם ייצור של פיקסלים רועשים.
לעומת זאת, אם משרעת הופ היא קטנה מדי, או נקודת הקבע גבוהה מדי, nanopipette עלול להתנגש עם המדגם וכתוצאה מכך חפצים הדמיה או נזק צרור שיער. הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא לבלות פחות מ 15 דקות לכל חבילת תא שיער בעת עבודה עם תאים חיים. לאחר קבלת תמונה של חבילת השיער, ניתן לנסות להשיג הקלטות ערוץ יחיד ממיקומים ספציפיים על פני השטח של סטריאוטיפיליה כדי לענות על שאלות על תכונות ערוץ mechanotransduction.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
