Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Hi-C in nucleus in drosophilacellen
Chapters
Summary September 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het genoom is georganiseerd in de nucleaire ruimte in verschillende structuren die kunnen worden onthuld door middel van chromosoom conformatie capture technologieën. De hi-c-methode in de kern biedt een genoombrede verzameling chromatine-interacties in Drosophila-cellijnen, die contactkaarten genereert die kunnen worden verkend met megabaseresolutie op beperkingsfragmentniveau.
Transcript
De nucleus Hi-C-protocollen maken het mogelijk om chromosomale bevestiging met verschillende resolutie te verkennen voor de karakterisering van chromatinelussen, domeinen en compartimenten die het genoom organiseren. Dit protocol biedt een hoge resolutie profilering van genomische interacties op verschillende schalen, wat een consistentere dekking oplevert over het volledige bereik van genomische afstanden en gegevens met minder technische ruis. Het combineren van dit protocol met genetische bewerking is een krachtige strategie voor het testen van de structurele functie van genetische elementen.
Het kan ook worden toegepast op de karakterisering van structurele variaties die tot ziekte leiden. Het nucleus Hi-C protocol kan worden toegepast om de genoomorganisatie van elk eukaryotisch genoom te verkennen. Het doen van SDS- en Triton-behandeling disaggregateert alle nucleaire klonten door pipetten omdat aggregaten de enzymatische reactie-efficiëntie verstoren, en zorg ervoor dat u de juiste kwaliteitscontroles uitvoert voordat u sequencing uitvoert.
Begin met het toevoegen van methanolvrije formaldehyde aan één maal 10 aan de zeven Schneider's Line 2 Plus Drosophila cellen in 17,5 milliliter Schneider medium aangevuld met 10%FBS tot een eindconcentratie van 2%Incubeer de cellen gedurende 10 minuten op kamertemperatuur met mengen om de 60 seconden of op een draaiend wiel, en voeg glycine toe aan een eindconcentratie van 0,125 molair met mengen. Na vijf minuten bij kamertemperatuur en 15 minuten op ijs, verzamel de cellen door centrifugeren en resuspendeer de pellet voorzichtig in 25 milliliter koude PBS en verzamel de cellen met een andere centrifugeren. Aan het einde van de centrifugeren, resuspend de cellen in een milliliter ijskoude lysis buffer voor het tellen en pas de cellen aan een keer 10 aan de zes cellen per milliliter concentratie.
Incubeer de cellen gedurende 30 minuten op ijs en keer de buis om de twee minuten om om de cellen te mengen en te verzamelen met een andere centrifugeer. Resuspendeer de pellet in een milliliter verse ijskoude lysisbuffer. Was na centrifugeren het lysaat met één milliliter 1,25X restrictiebuffer.
Centrifugeer opnieuw om het lysaat te verzamelen. Resuspend de pellet in 360 microliters verse beperkingsbuffer en 11 microliters van 10% SDS met zorgvuldig pipetten en incuberen gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius en 7 tot 950 omwentelingen per minuut met af en toe pipetten. Stop aan het einde van de incubatie de permeabilisatie met 75 microliters niet-ionische oppervlakteactieve stof en breng de buis nog eens 45 minuten terug naar de incubator met schudden bij 950 omwentelingen per minuut met af en toe pipetten.
Voeg voor chromatinevertering 200 eenheden Mbo1 toe aan de buis voor een incubatietijd van vier tot 16 uur bij 37 graden Celsius met rotatie. Aan het einde van de incubatie inactiveer het enzym met een incubatie van 20 minuten bij 60 graden Celsius. Om de overhangen van het beperkingsfragment op te vullen en de DNA-uiteinden te labelen met biotine, voegt u 1,5 microliter elk van 10 millimolar dCTP, dGTP, dTTP, 20 microliter van 0,4 millimolar biotine dATP, 17,5 microliter tris lage EDTA-buffer en 10 microliters van vijf eenheden per microliter DNA-polymerase één groot fragment aan de buis toe.
Incubeer de reactie gedurende 75 minuten bij 37 graden Celsius met schudden bij 700 omwentelingen per minuut elke 10 seconden gedurende 30 seconden. Voeg aan het einde van de incubatie de ligatiemix toe aan het chromatine en pas deze aan op een milliliter eindreactievolume met een grondige zachte menging en incubeer 's nachts bij 16 graden Celsius. Om de monstereiwitten af te afgebroken, voegt u 50 microliter van 10 milligram per milliliter proteinase K toe aan de buis voor een incubatietijd van twee uur bij 37 graden Celsius.
Verhoog aan het einde van de incubatie de temperatuur 's nachts tot 65 graden Celsius om het monster om te keren. De volgende ochtend, degradeer de RNA met 10 microliter van 10 milligram per milliliter RNAse A.Na een uur bij 37 graden Celsius, voeg een volume fenol chloroform toe aan de buis en meng grondig door inversie om een homogene witte fase te verkrijgen. Na het neerslaan van het DNA volgens standaardprotocollen, kwantificeer het DNA met behulp van een fluorogene kleurstof die selectief aan DNA bindt en een fluorometer volgens de instructies van de fabrikant.
Om het DNA te zuiveren van onverteerd en verteerd aliquots, laadt u 100 nanogram onverteerd, verteerd en ligated monsters op een 1,5% agarose gel en zoekt u naar een uitstrijkje gecentreerd rond 500 basisparen in het verteerde monster versus een hoge moleculaire gewichtsband voor het ligated monster. Om de Hi-C markering en ligatie-efficiëntie te controleren door versterking en vertering van een bekende interactie, na PCR, verteer de producten met Mbo1, Cla1 of beide, en voer de monsters uit op een nieuwe gel van 1,5 tot 2%, zodat het relatieve aantal 3C- en Hi-C-ligatieverbindingen kan worden schatting. Na het sonischen van het monster om 200 tot 500 DNA-fragmenten van het basispaar te verkrijgen, breng je 130 microliters met vijf microgram DNA uit elk monster over in nieuwe microcentrifugebuizen met 16 microliters van 10X ligatiebuffer, twee microliters van 10 millimolar dATP, vijf microliters T4 DNA-polymerase en zeven microliters dubbel gedestilleerd water voor een incubatie van 30 minuten bij 20 graden Celsius.
Voeg aan het einde van de incubatie vijf microliters van 10 millimolar dNTPs, vier microliters van 10X ligatiebuffer, vijf microliters T4 polynucleotidekinase, één microliter DNA-polymerase één groot fragment en 25 microliters dubbel gedestilleerd water toe aan de buizen voor een tweede incubatietijd van 30 minuten bij 20 graden Celsius. Om fragmenten te selecteren, meestal in het bereik van 250 tot 550 basisparen, voert u sequentiële vaste fase omkeerbare en mobilisatiegrootteselectie uit met 0,6X, vervolgens 0,9X volgens de instructies van de fabrikant en elute het DNA met 100 microliters tris lage EDTA. Voor biotine pulldown voor elke bibliotheek, was 150 microliters Streptavidin-gebonden magnetische kralen twee keer met 400 microliters van 1X Tween buffer en draai de monsters gedurende drie minuten op een roterend wiel.
Aan het einde van de incubatie, resuspend de kralen in 300 microliters van 2x geen Tween buffer en meng met 300 microliters hi-C materiaal voor een rotatie van 30 minuten op een roterend wiel. Was aan het einde van de incubatie de kralen met 400 microliter 0,5X Tween buffer voor een incubatie van drie minuten bij 55 graden Celsius en 750 omwentelingen per minuut, gevolgd door twee wasbeurten in 200 microliters van 1X beperkingsbuffer per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt, resuspend de kralen in 100 microliter dATP tailing mix voor een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius.
Aan het einde van de incubatie, resuspend de kralen in 50 microliters van 1X ligatie buffer en breng de suspensie over naar een nieuwe buis met vier microliters voorgegloeide gekoppelde eindadapters en twee microliters van T4 ligase. Verwijder na twee uur bij kamertemperatuur het supernatant en was de kralen twee keer met 400 microliter Tween-buffer, was de kralen vervolgens één keer met 200 microliters zonder Tween-buffer en één keer met 100 microliters beperkingsbuffer voordat u de kralen opnieuw opschort in 40 microliters van 1X-beperkingsbuffer. Een uitstrijkje van 200 tot 1.000 basisparen wordt waargenomen wanneer beperking met Mbo1 succesvol is.
Als de ligatie succesvol is, wordt een band met een hoog molecuulgewicht waargenomen aan de bovenkant van de gel. De efficiëntie van de spijsvertering kan ook worden bevestigd door kwantitatieve PCR. Een acceptabele spijsverteringsefficiëntie is 80% of hoger.
Zoals geïllustreerd, kan de versterking van een bekende interactie op middellange afstand in Hi-C ligatieproducten worden geschat door de vertering van het PCR-product dat in de versterking wordt teruggewonnen. Een spijsverteringsefficiëntie van meer dan 70% wordt aanbevolen om te voorkomen dat een groot deel van de niet-nuttige leesingen voor de bibliotheken na sequencing wordt geleverd. Het aantal PCR-cycli voor de uiteindelijke versterking moet één cyclus lager zijn dan het aantal cycli waarvoor het uitstrijkje zichtbaar is.
Het niveau van vertering van de bibliotheek geeft de overvloed aan geldige Hi-C-paren aan en weerspiegelt het aandeel nuttige leesvoer dat uit de bibliotheek zal worden verkregen. Met behulp van de unieke geldige Hi-C-paren kan een basisanalyse van de paarverdeling worden uitgevoerd. Zoals waargenomen in dit representatieve voorbeeld, kan de NOTCH-gen locus worden gezien samen met de architecturale eiwitten, domeinen één en twee, en histonmodificaties langs de locus.
Bij verwijdering van het gebied dat zowel de CTCF- als M1BP DNA-bindingsplaatsen bevat, kan een dramatische verandering in chromatinecontacten worden waargenomen. Na het Hi-C-experiment kan een worden uitgevoerd om een specifieke set contactpersonen te bereiken, bijvoorbeeld uit promotorregio's. Dit is vooral handig bij het beoordelen van grote genomen.
Zoals aangetoond, kan de combinatie van het Hi-C-protocol met genetische toevoeging worden gebruikt om de structurele en regulerende functie van genomische elementen te beoordelen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
