Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In-Nucleus Hi-C i Drosophila-celler
Chapters
Summary September 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Genomet er organisert i atomrommet i forskjellige strukturer som kan avsløres gjennom kromosomkonformasjonsfangstteknologier. Hi-C-metoden i kjernen gir en genomomfattende samling av kromatininteraksjoner i Drosophila-cellelinjer, som genererer kontaktkart som kan utforskes med megabaseoppløsning på begrensningsfragmentnivå.
Transcript
Kjernen Hi-C-protokollene tillater utforskning av kromosomal bekreftelse med forskjellig oppløsning for karakterisering av kromatinløkker, domener og rom som organiserer genomet. Denne protokollen gir høyoppløselig profilering av genomiske interaksjoner i forskjellige skalaer, noe som gir en mer konsistent dekning over hele spekteret av genomiske avstander og data med mindre teknisk støy. Å kombinere denne protokollen med genetisk redigering er en kraftig strategi for å teste den strukturelle funksjonen til genetiske elementer.
Det kan også brukes på karakterisering av strukturelle variasjoner som fører til sykdom. Kjernen Hi-C-protokollen kan brukes til å utforske genomorganisasjonen til ethvert eukaryotisk genom. Å gjøre SDS- og Triton-behandling disaggregaterer eventuelle kjernefysiske klumper ved pipettering, da aggregater forstyrrer enzymatisk reaksjonseffektivitet, og sørg for å utføre riktig kvalitetskontrollmål før sekvensering.
Begynn med å legge til metanolfri formaldehyd til en gang 10 til de syv Schneiders Line 2 Plus Drosophila-celler i 17,5 milliliter Schneider-medium supplert med 10% FBS til en endelig konsentrasjon på 2% Inkuber cellene i 10 minutter ved romtemperatur med blanding hvert 60. og tilsett glycin til en endelig konsentrasjon på 0,125 molar med blanding. Etter fem minutter ved romtemperatur og 15 minutter på is, samle cellene ved sentrifugering og forsiktig gjenopplive pellet i 25 milliliter kald PBS og samle cellene med en annen sentrifugering. På slutten av sentrifugeringen, resuspend cellene i en milliliter iskald lysis buffer for telling og justere cellene til en en ganger 10 til seks celler per milliliter konsentrasjon.
Inkuber cellene på is i 30 minutter, inverter røret hvert annet minutt for å blande og samle cellene med en annen sentrifugering. Resuspend pellet i en milliliter frisk is kald lysis buffer. Etter sentrifugering, vask lysatet med en milliliter 1,25X begrensningsbuffer.
Sentrifuge igjen for å samle lysate. Resuspend pellet i 360 mikroliter av fersk begrensning buffer og 11 mikroliter av 10%SDS med forsiktig pipettering og inkubere i 45 minutter ved 37 grader Celsius og 7 til 950 omdreininger per minutt med sporadisk pipettering. På slutten av inkubasjonen, stopp permeabiliseringen med 75 mikroliter ikke-ionisk overflateaktivt middel og returner røret til inkubatoren i ytterligere 45 minutter med risting ved 950 omdreininger per minutt med sporadisk pipettering.
For kromatin fordøyelse, tilsett 200 enheter av Mbo1 til røret for en fire til 16-timers inkubasjon ved 37 grader Celsius med rotasjon. På slutten av inkubasjonen inaktiverer du enzymet med 20-minutters inkubasjon ved 60 grader Celsius. For å fylle ut begrensningsfragmentoverhengene og merke DNA-endene med biotin, tilsett 1,5 mikroliter hver av 10 millimolar dCTP, dGTP, dTTP, 20 mikroliter 0,4 millimolar biotin dATP, 17,5 mikroliter tris lav EDTA-buffer og 10 mikroliter av fem enheter per mikroliter DNA-polymerase ett stort fragment til røret med forsiktig blanding.
Inkuber reaksjonen i 75 minutter ved 37 grader Celsius med risting ved 700 omdreininger per minutt hvert 10. På slutten av inkubasjonen, legg til ligationblandingen til kromatin og juster den til en milliliter endelig reaksjonsvolum med grundig skånsom blanding og inkuber over natten ved 16 grader Celsius. For å forringe prøveproteinene, tilsett 50 mikroliter 10 milligram per milliliter proteinase K til røret for en to timers inkubasjon ved 37 grader Celsius.
På slutten av inkubasjonen, øk temperaturen til 65 grader Celsius over natten for å reversere krysskobling av prøven. Neste morgen, forring RNA med 10 mikroliter på 10 milligram per milliliter RNAse A.Etter en time ved 37 grader Celsius, legg til ett volum fenolklorform til røret og bland grundig ved inversjon for å oppnå en homogen hvit fase. Etter å ha utfelt DNA i henhold til standardprotokoller, kvantifisere DNA ved hjelp av et fluorogent fargestoff som binder selektivt til DNA og et fluorometer i henhold til produsentens instruksjoner.
For å rense DNA-et fra ufordøyde og fordøyde aliquots, last 100 nanogram ufordøyd, fordøyd og ligated prøver på en 1,5% agarose gel og se etter et smør sentrert rundt 500 basepar i den fordøyde prøven kontra et høyt molekylvektbånd for den ligaterte prøven. For å verifisere Hi-C-merkingen og ligasjonseffektiviteten ved forsterkning og fordøyelse av en kjent interaksjon, etter PCR, fordøye produktene med Mbo1, Cla1 eller begge deler, og kjør prøvene på en ny 1,5 til 2% gel for å tillate estimering av det relative antallet 3C- og Hi-C-ligationkryss. Etter sonikering av prøven for å oppnå DNA-fragmenter på 200 til 500 basepar, overføre 130 mikroliter med fem mikrogram DNA fra hver prøve til nye mikrocentrifugerør som inneholder 16 mikroliter 10X ligasjonsbuffer, to mikroliter 10 millimolar dATP, fem mikroliter T4 DNA-polymerase og syv mikroliter dobbelt destillert vann for en 30-minutters inkubasjon ved 20 grader Celsius.
På slutten av inkubasjonen legger du til fem mikroliter med 10 millimolar dNTPer, fire mikroliter 10X ligasjonsbuffer, fem mikroliter T4 polynukleotidkinase, en mikroliter DNA-polymerase ett stort fragment og 25 mikroliter dobbelt destillert vann til rørene for en andre 30-minutters inkubasjon ved 20 grader Celsius. For å velge fragmenter for det meste i størrelsesområdet 250 til 550 basepar, utfør sekvensiell solid fase reversibel og mobiliseringsstørrelsesvalg med 0,6X, deretter 0,9X i henhold til produsentens instruksjoner og elute DNA med 100 mikroliter tris lav EDTA. For biotin pulldown for hvert bibliotek, vask 150 mikroliter Streptavidin-koblede magnetiske perler to ganger med 400 mikroliter 1X Tween buffer og roter prøvene i tre minutter på et roterende hjul.
På slutten av inkubasjonen, resuspend perlene i 300 mikroliter av 2X ingen Tween buffer og bland med 300 mikroliter Hi-C materiale for en 30-minutters rotasjon på et roterende hjul. På slutten av inkubasjonen, vask perlene med 400 mikroliter 0,5X Tween buffer for en tre minutters inkubasjon ved 55 grader Celsius og 750 omdreininger per minutt, etterfulgt av to vasker i 200 mikroliter med 1X begrensningsbuffer per vask. Etter den andre vasken, resuspend perlene i 100 mikroliter dATP tailing blanding for en 30-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius.
På slutten av inkubasjonen, resuspend perlene i 50 mikroliter av 1X ligation buffer og overføre suspensjonen til et nytt rør som inneholder fire mikroliter pre-annealed parret end adaptere og to mikroliter av T4 ligase. Etter to timer ved romtemperatur, fjern supernatanten og vask perlene to ganger med 400 mikroliter Tween buffer, vask deretter perlene en gang med 200 mikroliter uten Tween-buffer og en gang med 100 mikroliter begrensningsbuffer før du suspenderer perlene i 40 mikroliter med 1X-bufferbegrensning. Et smør på 200 til 1000 basispar observeres når begrensningen med Mbo1 er vellykket.
Hvis ligasjonen er vellykket, observeres et høyt molekylvektbånd på toppen av gelen. Fordøyelseseffektivitet kan også bekreftes av kvantitativ PCR. En akseptabel fordøyelseseffektivitet er 80% eller høyere.
Som illustrert kan forsterkningen av en kjent mellomtoneinteraksjon i Hi-C-ligasjonsprodukter estimeres ved fordøyelsen av PCR-produktet som er gjenvunnet i forsterkningen. En fordøyelseseffektivitet på mer enn 70%anbefales for å unngå å ha en stor andel av ikke-nyttige lesninger for bibliotekene etter sekvensering. Antall PCR-sykluser for den endelige forsterkningen bør være en syklus mindre enn antall sykluser som smøret er synlig for.
Nivået på fordøyelsen av biblioteket indikerer overflod av gyldige Hi-C-par og gjenspeiler andelen nyttige lesninger som vil bli hentet fra biblioteket. Ved hjelp av de unike gyldige Hi-C-parene kan grunnleggende analyse av pardistribusjonen utføres. Som observert i dette representative eksemplet, kan NOTCH-genet locus ses sammen med arkitektoniske proteiner, domener en og to, og histone modifikasjoner langs gresset.
Ved sletting av regionen som inneholder både CTCF og M1BP DNA-bindingssteder, kan en dramatisk endring i kromatinkontakter observeres. Etter Hi-C-eksperimentet kan en utføres for å nå et bestemt sett med kontakter, for eksempel fra promotorregioner. Dette er spesielt nyttig ved vurdering av store genomer.
Som demonstrert kan kombinasjon av Hi-C-protokollen med genetisk tilsetning brukes til å vurdere den strukturelle og regulatoriske funksjonen til genomiske elementer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.