Bioengineering
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generatie van zelfgeassembleerde vasculariseerde menselijke huidequivalenten
Chapters
Summary February 12th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het doel van dit protocol is om de generatie- en volumetrische analyse van gevasculariseerde menselijke huidequivalenten te beschrijven met behulp van toegankelijke en eenvoudige technieken voor langetermijncultuur. Voor zover mogelijk wordt de reden voor stappen beschreven om onderzoekers in staat te stellen zich aan te passen op basis van hun onderzoeksbehoeften.
Transcript
Het detail in dit protocol richt zich op de menselijke huidequivalentgeneratie, wat vaak technisch uitdagend is. Nieuwe menselijke huidequivalente protocolelementen, zoals vasculatuur en volumetrische beeldvorming zijn inbegrepen. De techniek maakt de eenvoudige constructie van een huidmodel mogelijk dat nauwer aansluit bij in-vivo weefsel voor de studie van ziekten, veroudering en gepersonaliseerde geneeskunde.
Het meest uitdagende deel van dit protocol is een overgang tussen onderdompeling en lucht-vloeistof interface. Het zal waarschijnlijk een paar proeven duren om de timing en medianiveaus te optimaliseren voor consistente resultaten. Voeg om te beginnen 516 microliters media toe aan een koud afgedekte buis en voeg onmiddellijk 375 microliters koud collageen toe met behulp van de 1000-microliter positieve verplaatsingspipet.
Verwijder de lege pipettip en schakel over op de voorbereide 250-microliter positieve verplaatsingspipet om te mengen. Meng snel, maar voorzichtig om overtollige bubbelvorming te voorkomen. Houd de punt in de oplossing, meng gelijkmatig vanuit verschillende posities van de buis totdat de oplossing van homogene kleur is, wat meestal ongeveer vijf pipetcycli of 10 seconden duurt.
Verspreid onmiddellijk 125 microliters acellulair collageen op het membraan van de 12-put kweekinzet. Om een uniforme dekking te garanderen, kantelt u de plaat en gebruikt u de pipettip om het membraan te schilderen door collageen voorzichtig rond te verspreiden. Verplaats de 12-put plaat onmiddellijk naar een 37 graden Celsius celkweek incubator om deze minstens 20 minuten te laten geleren.
Haal na de gelatieperiode de 12-put plaat acellulair collageen uit de incubator. Verwijder de buis met een dop van 1,7 milliliter uit nat ijs, verwijder vervolgens het stamcollageen uit de koeling en plaats het op nat ijs met het deksel open. Voeg 516 microliters gekoelde celsuspensie toe aan de koud afgedekte buis.
Gebruik de pipet van 1000 microliter om onmiddellijk 375 microliter koude collageenoplossing rechtstreeks in de oplossing in de afgedekte buis te pipetten. Verwijder al het collageen uit de pipet in de buis en gooi de pipetpunt met positieve verplaatsing weg. Schakel onmiddellijk over naar de pipet van 250 microliter en meng de collageenoplossing Eenmaal gemengd, breng 250 microliters cellulaire collageenoplossing over op de acellulaire collageensteunen in de 12-put kweekinzet en verplaats vervolgens de 12-putplaat naar een celkweek-incubator van 37 graden Celsius.
Kantel na de geltijd van 30 minuten voorzichtig de plaat om de gelatie te beoordelen en zorg ervoor dat het collageen is gestold. Voeg respectievelijk 500 microliters en 1000 microliters mengmedia toe aan de bovenkamer en de onderste kamer van de insert. Zorg ervoor dat de collageengel onder water staat en voeg indien nodig meer media toe.
Plaats de putplaat in de celkweek-incubator voor nachtelijke incubatie. Gebruik op dag zeven van de onderdompeling een handmatige pipet om media uit de onderste en bovenste kamer van elke constructieput te verzamelen en weg te gooien. Om media te verzamelen die direct onder het doorlatende membraan vastzitten, plaatst u de pipetpunt onder het membraan en slaat u het inzetstuk tijdelijk uit zijn plaats.
Voeg een milliliter menselijke huidequivalent of HSE-media aangevuld met 5%FPS toe aan de onderste kamer van elke put en 200 microliter celsuspensie aan de bovenste kamer van elke put. Zaai de keratinocyten rechtstreeks op het huidconstructieoppervlak en laat ze twee uur in de incubator bezinken. Voeg twee uur na het zaaien van de keratinocyten voorzichtig 300 microliters HSE-media toe, aangevuld met 5% FPS aan de bovenste kamer van elke constructieput.
Plaats de constructie na het laden van de media terug in de incubator. Til met behulp van een handmatige pipet elke constructie op naar hun lucht-vloeistofinterface, of ALI, door mediaafval alleen uit de bovenste kamer te verwijderen. Probeer zo dicht mogelijk bij de epidermale laag te komen zonder deze aan te raken of te beschadigen.
Kantel de platen iets onder verschillende hoeken om de media te verzamelen en voeg vervolgens ongeveer twee milliliter steriel water toe aan de omringende putten in de plaat om een consistente vochtigheid te behouden. Controleer de plaat een paar uur later om er zeker van te zijn dat de keratinocyten nog steeds bij de ALI zijn. Verwijder alle media in de bovenste kamer en houd bij hoeveel media uit elke put worden verwijderd.
De epidermale lagen moeten er gehydrateerd uitzien, niet droog, maar er mogen geen media bovenop de constructie worden gepoold. Om de constructie voor immunofluorescente kleuring voor te bereiden, draait u een inzetstuk ondersteboven en plaatst u het over de put op de putplaat. Stabiliseer het inzetstuk met één hand terwijl u een fijne tip forceps of een precisiemes gebruikt om ongeveer de helft van de omtrek van het membraan te snijden.
Snijd zo dicht mogelijk bij de plastic behuizing. Pak met behulp van de fijne tip forceps de rand van de gesneden membraanklep en pel het poreuze membraan voorzichtig van het inzetstuk en de VHSE-constructie. Als de constructie vast komt te zitten aan de zijkant van de kamer, gebruik dan de fijne tip forceps of een kleine scoopula om hem naar de put te verplaatsen.
Zodra de VHSE zich in de put bevindt, gooit u de resterende stukken van het wisselplaatmembraan weg en houdt u de kweekinzetbehuizing in elke put om de VHSE's tijdens het kleuren in een ondergedompelde positie te houden. Bereid twee dagen voor beeldvorming polydimethylsiloxaan of PDMS voor. Plaats elk schoon mengvat op een weegbalans en tarra de weegschaal.
Voeg de basis toe en voeg vervolgens de crosslinker toe. Roer de oplossing minstens vier minuten krachtig, waardoor kleine bubbels ontstaan. Giet na voldoende mengen het PDMS in een Petrischaal van 90 of 100 millimeter.
Ontgast het PDMS in een vacuümkamer totdat alle bellen verdwijnen en het PDMS helder is. Laat het vacuüm langzaam los en verwijder het PDMS. Zet de schaal in een oven om 's nachts uit te harden op 50 tot 60 graden Celsius, zorg ervoor dat de schaal plat zit zodat PDMS gelijkmatig kan uitharden.
Gebruik een dag voor de beeldvorming een stalen pons of een handprecisiemes om een cirkelvormige put van het PDMS-vel te ponsen of uit te snijden, ongeveer even groot als de VHSE-constructie. Snijd een vierkante patch rond de cirkelvormige put om een enkele PDMS-put te maken. Gebruik een glazen afdekstrip van een vergelijkbare grootte als de PDMS-put voeg cyanoacrylaatlijm toe aan het onderste oppervlak van het PDMS en smeer gelijkmatig in met een wegwerppipetpunt.
Centreer het glas en druk het op de PDMS-put terwijl u een helder glazen venster binnen de geperforeerde cirkel laat. Laat de lijm een nacht drogen voor gebruik. Karakterisering van de epidermis en dermis vertonen geschikte immunofluorescente markers voor de menselijke huid in de VHSE-constructies.
Cytokeratine 10 is een vroege differentiatie keratinocyt marker die meestal markeert alle suprabasale lagen in huidequivalenten. Involucrine en filaggrin zijn late differentiatiemarkers in keratinocyten en markeren de bovenste meest suprabasale lagen in huidequivalenten. Het wissen van de VHSE maakte eenvoudige beeldvorming in één instelling mogelijk en elimineerde de noodzaak om de constructie opnieuw teoriënteren om de dermis en epidermis afzonderlijk weer te geven.
Volumetrische afbeeldingen maken het mogelijk om 3D-renderings te genereren om vasculatuur in elke constructie in kaart te brengen. Afbeeldingsstacks werden geladen in rekensoftware en een aangepast algoritme werd gebruikt voor 3D-rendering en kwantificering. Skeletonisatie bepaalde het definitieve centrum van elk collageen IV-gemarkeerd vat en de resulterende gegevens werden gebruikt om de diameter van het vat en de vasculaire fractie te berekenen.
Na deze procedure kunnen karakteriseringsmethoden zoals barrièreanalyse, scanning elektronenmicroscopie, lipidenprofielen en andere worden uitgevoerd om te begrijpen hoe vasculatuur specifiek de epidermale rijping en stabiliteit beïnvloedt. Dit protocol maakt weefselrelevante en celtypespecifieke studies in een gevasculariseerd huidmodel mogelijk. Het is bijzonder geschikt voor onderzoek in veroudering en gepersonaliseerde geneeskunde.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
