Genetics
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साइट-निर्देशित ΠC31-मध्यस्थता एकीकरण और मलेरिया के Anopheles वैक्टर में कैसेट एक्सचेंज
Chapters
Summary February 2nd, 2021
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प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि एनोफिलीज़ मलेरिया मच्छरों के जीनोम में साइट-निर्देशित संशोधनों को कैसे प्राप्त किया जाए, जो कि ΠC31 प्रणाली का उपयोग कर रहे हैं। वर्णित संशोधनों में एटीपी-असर डॉकिंग लाइनों के जीनोम में ट्रांसजेनिक कैसेट के एकीकरण और विनिमय दोनों शामिल हैं।
Transcript
यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार के शारीरिक मार्गों में शामिल मच्छर जीन की भूमिका के लक्षण वर्णन का समर्थन करता है, जिसमें उदाहरण के लिए, कीट प्रतिरोध और मलेरिया परजीवी विकास शामिल हैं। विधि ट्रांसजीन सम्मिलन को एकल पूर्व-विशेषता वाले जीनोमिक स्थानों में चलाती है और इसलिए वैकल्पिक ट्रांसजीन के परिणामस्वरूप फेनोटाइप्स की तुलना करने की अनुमति देती है जो स्थितिगत प्रभाव के मुद्दे से प्रभावी ढंग से बचते हैं। इस विधि को सार्वजनिक स्वास्थ्य और कृषि महत्व की विभिन्न प्रकार की कीट प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है और इसके अनुप्रयोग बैक्टीरिया से स्तनधारी कोशिकाओं तक व्यापक रूप से फैले हुए हैं।
प्रमुख फ्लोरोसेंट मार्कर, एटीटीबी पुनर्संयोजन साइटों और वांछित ट्रांसजीन कार्गो को ले जाने वाले एटीबी दाता प्लास्मिड को डिजाइन करके शुरू करें। कैसेट विनिमय के लिए ट्रांसजेनिक कैसेट या दो उल्टे attB साइटों ले जाने वाले पूरे प्लास्मिड के एकीकरण के लिए एक एकल attB साइट का उपयोग करें। एक एंडोटॉक्सिन-मुक्त शुद्धिकरण किट का उपयोग करके दाता और सहायक प्लास्मिड को शुद्ध करें।
ATTB टैग दाता प्लास्मिड ब्याज के transgene ले जाने और सहायक प्लास्मिड integrase ले जाने के लिए दाता प्लास्मिड के प्रति माइक्रोलीटर 350 nanograms और सहायक प्लास्मिड के प्रति माइक्रोलीटर 150 nanograms की अंतिम एकाग्रता के साथ एक मिश्रण प्राप्त करने के लिए गठबंधन. तीन दाढ़ सोडियम एसीटेट की 0.1 मात्रा और बर्फ के ठंडे 100% इथेनॉल के 2.5 संस्करणों को जोड़कर डीएनए को अवक्षेपित करें, फिर भंवर। एक सफेद अवक्षेप तुरंत दिखाई देना चाहिए।
गोली को धोएं और प्रति माइक्रोलीटर 500 नैनोग्राम की कुल अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए इंजेक्शन बफर में इसे फिर से निलंबित करें। फिर प्रत्येक 10-15 माइक्रोलीटर के ऐलीकोट तैयार करें और उन्हें नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें। रक्त वांछित डॉकिंग लाइन से चार से सात दिन पुराने मच्छरों को खिलाता है और माइक्रो इंजेक्शन से 72 घंटे पहले उनके जंगली प्रकार के समकक्षों को खिलाते हैं।
45 डिग्री के कोण पर भ्रूण के पीछे के ध्रुव को लक्षित करके 25 मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड में एनोफिलीज़ गैम्बिया भ्रूण माइक्रो इंजेक्शन का प्रदर्शन करें। एक 30 डिग्री कोण पर पीछे के ध्रुव को लक्षित करके हेलोकार्बन तेल में Anopheles stephensi भ्रूण माइक्रो इंजेक्शन प्रदर्शन। इंजेक्शन के तुरंत बाद, अंडों को बाँझ आसुत पानी से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और उन्हें कीटीय स्थितियों में वापस कर दें।
हैचिंग पर, जी 0 लार्वा को नमकीन आसुत पानी के साथ एक ट्रे में दैनिक और पीछे प्यूपे में स्थानांतरित करें। एक स्टीरियोस्कोप के तहत सेक्स द्वारा G0 pupae सॉर्ट करें। पुरुषों को तीन से पांच के समूहों में अलग-अलग पिंजरों में उभरने की अनुमति दें और उम्र से मेल खाने वाली जंगली प्रकार की मादाओं की दस गुना अधिकता जोड़ें।
मादाओं को 10 से 15 के समूहों में अलग-अलग पिंजरों में उभरने की अनुमति दें और समान संख्या में आयु-मिलान वाले जंगली प्रकार के पुरुषों को जोड़ें। वयस्कों को चार से पांच दिनों के लिए संभोग करने और महिलाओं को रक्त भोजन प्रदान करने की अनुमति दें। अंडे ले लीजिए और अगली पीढ़ी G1s उभरते हुए पीछे.
गीले फिल्टर पेपर के साथ या माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पंक्तिबद्ध एक पेट्री डिश में जी 1, एल 3 और एल 4 लार्वा एकत्र करें और एटीटीबी टैग किए गए कार्गो के साथ पेश किए गए मार्कर की उपस्थिति के लिए एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोस्कोप का उपयोग करके उन्हें स्क्रीन करें। एकल attB डिजाइन के लिए, नए और preexisting मार्कर की उपस्थिति के लिए स्क्रीन. कैसेट विनिमय के लिए डबल attB डिजाइन के लिए, नए मार्कर की उपस्थिति और पहले से मौजूद एक के नुकसान के लिए स्क्रीन.
सॉर्ट सेक्स द्वारा G1 pupae परिवर्तित और विपरीत लिंग उम्र मिलान जंगली प्रकार व्यक्तियों के साथ उन्हें बड़े पैमाने पर पार. वयस्कों को चार से पांच दिनों के लिए संभोग करने और रक्त भोजन प्रदान करने की अनुमति दें। एकल एकीकरण प्रयोगों के लिए, एन मास क्रॉस से सीधे अंडे एकत्र करें।
कैसेट विनिमय प्रयोगों के लिए, एकल मादाओं से अंडे एकत्र करें और दो वैकल्पिक कैसेट अभिविन्यास की संभावित उपस्थिति के कारण आणविक मूल्यांकन पूरा होने तक संतान को अलग बनाए रखें। फ्लोरोसेंट मार्कर की उपस्थिति के लिए जी 2 संतानों की स्क्रीन करें और आणविक विश्लेषण के लिए जी 2 सकारात्मक व्यक्तियों के सबसेट को अलग रखें। बाकी को वयस्कता के लिए पीछे करें।
पाठ पांडुलिपि में वर्णित के रूप में PCR के साथ सम्मिलन साइटों के आणविक सत्यापन निष्पादित करें। एकल एकीकरण के लिए, सुनिश्चित करें कि अनुमानित सम्मिलन साइट मूल डॉकिंग निर्माण को वहन करती है, साथ ही दो हाइब्रिड साइटों एटीटीएल और एटीटीआर के बीच दाता प्लास्मिड का पूरा अनुक्रम। कैसेट एक्सचेंज के लिए, सुनिश्चित करें कि अनुमानित सम्मिलन साइट डॉकिंग लाइन के समान है जहां हाइब्रिड उल्टे एटीटीएल साइटें मूल उलटी एटीटीपी साइटों को प्रतिस्थापित करती हैं और एक्सचेंज टेम्पलेट मूल रूप से उनके बीच मौजूद कैसेट को बदल देता है।
प्रोटोकॉल का उपयोग लगभग 10 सप्ताह में एक स्थिर एनोफिलीज़ ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करने के लिए किया गया था। परिवर्तन के फेनोटाइपिक सत्यापन 3xP3 प्रमोटर द्वारा विनियमित फ्लोरोसेंट मार्करों के लिए स्क्रीनिंग द्वारा किया गया था यहाँ दिखाया गया है। एक नई एनोफिलीज़ स्टीफेंसी लाइन को सीएफपी के साथ चिह्नित डॉकिंग लाइन में एक डीएस लाल चिह्नित कैसेट के सम्मिलन द्वारा प्राप्त किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप जी 1 संतानों ने आंखों में लाल और नीले प्रतिदीप्ति द्वारा इंगित दोनों मार्करों को व्यक्त किया था।
कैसेट एक्सचेंज डिजाइन के परिणामस्वरूप मार्कर के प्रतिस्थापन में मूल रूप से दाता प्लास्मिड के साथ डॉकिंग लाइन में डाला जाता है। इस मार्कर विनिमय को एक एनोफिलीज़ गाम्बिया डॉकिंग लाइन में प्रदर्शित किया गया था जहां सीएफपी मार्कर खो गया था और वाईएफपी मार्कर का अधिग्रहण किया गया था जिसके परिणामस्वरूप पीली आंख और तंत्रिका कॉर्ड प्रतिदीप्ति होती है। कभी-कभी, आरएमसीई वांछित ट्रांसजेनिक कैसेट के आदान-प्रदान के बजाय एक एकल एकीकरण घटना में परिणाम कर सकता है जहां एक लार्वा को मूल सीएफपी और नए वाईएफपी मार्करों दोनों के साथ चिह्नित किया जाता है।
फ्लोरोसेंट मार्कर की उपस्थिति के लिए स्क्रीनिंग करते समय, संभावित पृष्ठभूमि ऑटो-प्रतिदीप्ति से इसके सिग्नल को अलग करना महत्वपूर्ण है। आवर्धन को बढ़ाना और ऊतकों और अंगों पर ध्यान केंद्रित करना जहां प्रतिदीप्ति को प्रमोटर द्वारा संचालित करने की उम्मीद है, सच्चे सीएफपी सकारात्मक व्यक्तियों की पहचान करने के लिए आवश्यक है। अपेक्षित सम्मिलन साइट की पुष्टि करने के लिए पीसीआर के माध्यम से व्यक्तिगत ट्रांसफॉर्मेंट का भी आणविक रूप से मूल्यांकन किया गया था।
एक एक्सचेंज Anopheles gambiae लाइन से व्यक्तियों में पीसीआर सत्यापन यहाँ दिखाया गया है। यहां तक कि उपयुक्त सूक्ष्म इंजेक्शन तकनीक, दाता और सहायक प्लास्मिड के सटीक डिजाइन और तैयारी, साथ ही साथ उचित मच्छर पालन योजना का पालन करना ट्रांसजेनिक व्यक्तियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया का उपयोग जीन ओवर-एक्सप्रेशन या साइलेंसिंग के कारण तत्वों को सम्मिलित करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, GAL4 / UAS प्रणाली, साथ ही साथ जीन ड्राइव तत्वों और मच्छर आनुवंशिक नियंत्रण के लिए एंटी-पैथोजन अणु।
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