Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Platsstyrd φC31-medierad integration och kassettutbyte i Anopheles vektorer av malaria
Chapters
Summary February 2nd, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Protokollet beskriver hur man uppnår platsstyrda modifieringar i genomet av Anopheles malariamyggor med hjälp av φC31-systemet . De ändringar som beskrivs omfattar både integration och utbyte av transgena kassetter i arvsmassan hos attP-bärande dockningslinjer.
Transcript
Detta protokoll stöder karakteriseringen av mygggenernas roll som är involverade i en mängd olika fysiologiska vägar, inklusive till exempel insektsresistens och malariaparasitutveckling. Metoden driver transgene insättning i enda fördefinierade genomiska platser och gör det därför möjligt att direkt jämföra fenotyper som härrör från alternativa transgenes effektivt undvika frågan om positionell effekt. Denna metod kan tillämpas på en mängd olika insektsarter av folkhälso- och jordbruksbetydelse och dess tillämpningar sträcker sig mycket från bakterier till däggdjursceller.
Börja med att designa attB donatorplasmider som bär den dominerande fluorescerande markören, attB-rekombinationsplatser och önskad transgene-last. Använd en enda attB-plats för integrering av hela plasmiden som bär den transgena kassetten eller två inverterade attB-platser för kassettbyte. Rena donator- och hjälpplasmider med hjälp av ett endotoxinfritt reningskit.
Kombinera den attB-märkta donatorplasmiden som bär den transgene av intresse och hjälparen plasmid som bär integrasen för att få en blandning med en slutlig koncentration på 350 nanogram per mikroliter av donatorplasmiden och 150 nanogram per mikroliter av hjälparens plasmid. Fäll ut DNA genom att tillsätta 0,1 volym tre molarnatriumacetat och 2,5 volymer iskall 100% etanol och virvel. En vit fällning ska vara omedelbart synlig.
Tvätta pelleten och återanvänd den i injektionsbuffert för att nå en total slutlig koncentration på 500 nanogram per mikroliter. Förbered sedan alikvoter på 10-15 mikroliter vardera och lagra dem på minus 20 grader Celsius. Blod matar fyra till sju dagar gamla myggor från önskad dockningslinje och deras vilda typ motsvarigheter 72 timmar före mikroinjektion.
Utför Anopheles gambiae embryo mikroinjektioner i 25 millimolar natriumklorid genom att rikta in sig på embryots bakre pol i 45 graders vinkel. Utför Anopheles stephensi embryo mikroinjektioner i halokarbonolja genom att rikta in sig på den bakre polen i 30 graders vinkel. Omedelbart efter injektionen överför du äggen till en Petri-maträtt fylld med sterilt destillerat vatten och återgår till insektsförhållanden.
Vid kläckning överför du G0 larva till en bricka med saltat destillerat vatten dagligen och bakre till puppar. Sortera G0-puppar efter kön under ett stereoskop. Låt hanarna dyka upp i separata burar i grupper om tre till fem och tillsätt ett tiofaldigt överskott av åldersmatchade vilda typkvinnor.
Låt honorna dyka upp i separata burar i grupper om 10 till 15 och lägg till ett lika stort antal åldersmatchade vilda män. Låt vuxna para sig i fyra till fem dagar och ge kvinnor en blodmåltid. Samla äggen och bakre framväxande nästa generations G1: or.
Samla in G1- , L3- och L4-larven i en Petri-skål fodrad med våtfilterpapper eller på en mikroskopbild och screena dem med hjälp av ett fluorescerande stereoskop för närvaron av markören som introduceras med den attB-märkta lasten. För enstaka attB-mönster, skärm för närvaron av den nya och befintliga markören. För dubbla attB-mönster för kassettbyte, skärm för närvaron av den nya markören och förlusten av den befintliga.
Sortera förvandlade G1-puppar efter kön och korsa dem en masse med motsatt kön åldersmatchade vilda typ individer. Låt vuxna para sig i fyra till fem dagar och ge en blodmåltid. För enstaka integrationsexperiment, samla ägg direkt från masskorset.
För kassettutbytesexperiment, samla ägg från enskilda honor och hålla avkomman separat tills molekylär bedömning är klar på grund av den potentiella närvaron av två alternativa kassettorienteringar. Screena G2-avkomman för närvaron av fluorescerande markören och avsätta en delmängd av G2-positiva individer för molekylär analys. Upp resten till vuxen ålder.
Utför molekylär validering av insättningsplatserna med PCR enligt beskrivningen i textmanuskriptet. För enkel integration, se till att den förväntade insättnings platsen bär den ursprungliga docknings konstruktionen, plus hela sekvensen av givaren plasmid mellan de två hybrid platser attL och attR. För kassettutbyte, se till att det förväntade insättningsstället är identiskt med dockningslinjen där hybrid inverterade attL-platser ersätter de ursprungliga inverterade attP-platserna och utbytesmallen ersätter kassetten som ursprungligen fanns mellan dem.
Protokollet användes för att generera en stabil Anopheles transgen linje i cirka 10 veckor. Fenotypisk validering av omvandling utfördes genom screening för fluorescerande markörer som regleras av 3xP3 promotorn visas här. En ny Anopheles stephensi linje erhölls genom införande av en DS röd märkt kassett i en dockningslinje märkt med CFP vilket resulterade i G1 avkomma uttrycker båda markörer som anges av den röda och blå fluorescensen i ögonen.
Kassettutbytesdesigner resulterar i att markören som ursprungligen sattes in i dockningslinjen ersätts med givarplasmidens. Denna markör utbyte visades i en Anopheles gambiae docknings linje där den gemensamma fiskeripolitiken markören förlorades och YFP markör förvärvades resulterar i gula ögat och nerv sladd fluorescence. Ibland kan RMCE resultera i en enda integrationshändelse istället för utbyte av önskad transgen kassett där en larva är markerad med både den ursprungliga gemensamma fiskeripolitiken och de nya YFP-markörerna.
Vid screening för förekomst av en fluorescerande markör är det viktigt att skilja dess signal från eventuell bakgrund auto-fluorescens. Att öka förstoringen och fokusera på vävnader och organ där fluorescens förväntas drivas av promotorn är nödvändigt för att identifiera sanna positiva individer inom den gemensamma fiskeripolitiken. Enskilda transformanter bedömdes också molekylärt via PCR för att bekräfta den förväntade insättningspunkten.
PCR-validering hos individer från en utbytes Anopheles gambiae-linje visas här. Även lämplig mikroinjektionsteknik, noggrann design och förberedelse av donator- och hjälparplasmider, samt att följa lämpligt mygghållningssystem är nyckeln till att få transgena individer. Denna procedur kan användas för att sätta in element som orsakar genöveruttryck eller ljuddämpning, till exempel GAL4/UAS-systemet, liksom gendrivelement och antipatogenmolekyler för mygggenetisk kontroll.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
