Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Celdissociatie van het tongepitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale dag 12,5 en 8 weken oude muizen
Chapters
Summary January 21st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We hebben een gegeneraliseerd protocol ontwikkeld om een grote hoeveelheid hoogwaardige enkelvoudige cellen te scheiden van het epitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale en volwassen muistongs.
Transcript
Hoge opbrengst en kwaliteit van cellen uit complexe weefsels zijn essentieel voor veelgebruikte experimentele analyse, zoals RNA-sequencing met één cel en primaire stamcelculturen. Dit protocol genereert gezonde cellen met een hoge opbrengst en kwaliteit uit verschillende regio's en weefselcompartimenten van de zoogdiertong, waaronder tongepitheel en bindweefsel. Om het epitheel te scheiden van het mesenchyme van een E 12,5 muistong, breng je de geëuthanaseerde zwangere vrouwelijke muis over naar het operatiegebied en bevochtig je de buik van de muis met 70% ethanol om te voorkomen dat bont op de operatieplaats komt.
Open de buik met een ontleedschaar om de baarmoederhoorns bloot te leggen die de embryo's dragen, ontleed de baarmoederhoorns en breng ze over naar een 15 milliliter verse Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 millimeter. Gebruik onder een ontleedmicroscoop een minischaar en een fijne tang om de embryo's uit de baarmoederhoorns te ontleden. Open de mondholte met de fijne tang en ontleed de tong uit de onderkaak met behulp van een minischaar.
Was de tongen met 15 milliliter verse steriele Tyrode's oplossing in een kweekschaal van 100 millimeter. Breng vervolgens de weefsels over op twee milliliter van een enzymmengsel van dispase en collageen in een 35 millimeter kweekschaal en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Breng de tongen over op 15 milliliter verse steriele Tyrode-oplossing en scheid het mesenchym en het epitheel voorzichtig van de ventrale kant met behulp van een fijne tang.
Was de gescheiden epithelia en mesenchym tweemaal in 15 milliliter verse steriele Tyrode-oplossing. Om het tongepitheel te scheiden van het onderliggende bindweefsel van een volwassen muis, breng je de geëuthanaseerde muis over naar het operatiegebied en maak je de muiskop nat met 70% ethanol om te voorkomen dat bont in de mondholte komt. Gebruik een ontleedschaar om de mondhoeken langs de wang te snijden om de mondholte te openen.
Ontleed de tong met een onderkaak, was hem en plaats deze in een plastic schaal met een laag plasticfolie. Injecteer met behulp van een chirurgische tang om de tong vast te houden het enzymmengsel van dispase en collagenase in de subepitheliale ruimte van de tong door de snijkant van de achterste tong. Injecteer een milliliter enzymmengsel gelijkmatig op de hele tong voor weefselverzameling en injecteer vervolgens lokaal 0,5 milliliter enzymmengsel op de voorste tong voor weefselverzameling vanaf de tongpunt of op de achterste tong voor het verzamelen van papillaweefsel.
Wikkel de tong in met plasticfolie en incubeer deze gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius. Gebruik een minischaar om de circumvallate papilla en tongpunt te ontleden. Breng vervolgens een weefsel over naar 15 milliliter verse steriele Tyrode's oplossing.
Scheid het epitheel van het onderliggende bindweefsel in het enzym verteerde subepitheliale ruimte met behulp van een minischaar en trim de weefsels tot een juiste grootte, volgens de vereiste van downstream-experimenten. Was het gescheiden epitheel en het onderliggende bindweefsel tweemaal in 15 milliliter verse steriele Tyrode's oplossing in een kweekschaal van 100 millimeter. Breng de weefsels over op drie milliliter van 0,25% trypsine EDTA in een nieuwe 35 millimeter kweekschaal.
Incubeer de schaal gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius en roer de weefsels voorzichtig om de vijf minuten met een milliliter pipetpunten. Voeg 500 microliters van 5% FBS in DMEM F12 toe om de reactie te stoppen en breng het medium over naar een vijf milliliter laagbindende centrifugebuis. Centrifugeer de celsuspensie gedurende acht minuten bij kamertemperatuur op 200 maal G en verwijder het supernatant.
Resuspend de cellen voorzichtig in drie milliliter DMEM F12 met 10%FBS en 1%BSA, en filtreer de cellen met een 70 micrometer celzeef, gevolgd door een 35 micrometer celzeef. Centrifugeer de celsuspensie gedurende acht minuten op 200 maal G bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens het grootste deel van het medium, waarbij 50 tot 300 microliters als eindvolume overblijven om de cellen te resuspenderen. In de embryonale muistong is een opening in de subepitheliale ruimte zichtbaar na een goede enzymvertering.
In de volwassen muistong wordt een succesvolle enzyminjectie aangegeven door zwelling in de geïnjecteerde gebieden, wat suggereert dat het enzym door de tong kan worden vastgehouden. Na het bundelen van E12,5 tongen epitheelbladen en dunne lagen mesenchyme, toonde handmatig celtelling aan dat het protocol in totaal 63.917 cellen opleverde met een levensvatbaarheid van 95,2% van de epitheelbladen, en 294, 333 cellen in totaal met een levensvatbaarheid van 96,3% van het mesenchyme. Toen 10 volwassen tongen op acht weken leeftijd werden gebruikt, leverde het protocol 187, 333 cellen op met een levensvatbaarheid van 95,4% uit epitheelbladen van de tongpunt, 544.000 cellen met een levensvatbaarheid van 96,3% uit epitheelbladen van circumvallaat papillen en 150. 500 cellen met een levensvatbaarheid van 93% uit bindweefsel.
Volgens dit protocol kunnen de gedissocieerde cellen worden gebruikt voor RNA-sequencing met één cel en 3D-testorganoïdecultuur om niet-herkende testgenitorcellen onder het linguale epitheel te definiëren.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
