ניתוק תאים מאפיתל הלשון ומיסנצ'ימה/רקמת החיבור של עכברים בני 12.5 ו-8 שבועות

תשואה גבוהה ואיכות של תאים מרקמות מורכבות חיוניים לניתוח ניסיוני נפוץ, כגון רצף RNA של תא יחיד ותרביות תאי גזע ראשוניות. פרוטוקול זה יוצר תאים בריאים בתפוקה גבוהה ואיכות מאזורים שונים ותאי רקמות של לשון היונקים, כולל אפיתל לשון ורקמת חיבור. כדי להפריד את האפיתל מ mesenchyme של לשון העכבר E 12.5, להעביר את העכבר הנשי בהריון המתת חסד לאזור כירורגי להרטיב את הבטן העכבר עם 70% אתנול כדי למנוע פרווה מלהיכנס לאתר ההפעלה.

פתח את הבטן באמצעות מספריים מנתחים כדי לחשוף את קרני הרחם הנושאות את העוברים, לנתח את קרני הרחם ולהעביר אותם לתמיסה של 15 מיליליטר של טיירוד טרי בצלחת תרבות של 100 מילימטר. תחת מיקרוסקופ מנתח, להשתמש במספריים מיני מלקחיים בסדר לנתח את העוברים מקרני הרחם. פתח את חלל הפה עם מלקחיים עדינים לנתח את הלשון מן הלסת התחתונה באמצעות מספריים מיני.

לשטוף את הלשונות עם 15 מיליליטר של פתרון טרי סטרילי Tyrode בצלחת תרבות 100 מילימטר. ואז להעביר את הרקמות לשני מיליליטר של תערובת אנזים של dispase ו קולגן בצלחת תרבות 35 מילימטר דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את הלשונות ל-15 מיליליטר של הפתרון הסטרילי הטרי של טיירוד ומפרידים בעדינות את המזנצ’ים והאפיתל מהצד הגחוני באמצעות מלקחיים עדינים.

לשטוף את האפיתליה מופרדים mesenchyme פעמיים ב 15 מיליליטר של הפתרון של Tyrode סטרילי טרי. כדי להפריד את אפיתל הלשון מרקמת החיבור הבסיסית של עכבר בוגר, להעביר את העכבר מורדם לאזור כירורגי להרטיב את ראש העכבר באמצעות 70% אתנול כדי למנוע פרווה להיכנס לחלל הפה. השתמש ניתוח מספריים כדי לחתוך את הפינות של הפה לאורך הלחי כדי לפתוח את חלל הפה.

לנתח את הלשון עם הלסת התחתונה, לשטוף אותו ומניחים אותו בצלחת פלסטיק עם שכבה של ניילון נצמד. באמצעות מלקחיים כירורגיים להחזיק את הלשון, להזריק את תערובת האנזים של dispase וקולאז’נים בחלל subepithelial של הלשון דרך הקצה החוד החנית של הלשון האחורית. להזריק מיליליטר אחד של תערובת אנזימים באופן שווה לכל הלשון לאיסוף רקמות, ולאחר מכן להזריק 0.5 מיליליטר של תערובת אנזימים מקומית ללשון הקדמונית לאיסוף רקמות מקצה הלשון או ללשון האחורית לאיסוף רקמת פפילה circumvallate.

עוטפים את הלשון בניילון נצמד ומדגרים אותה במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. השתמש מספריים מיני לנתח את פפילה circumvallate ואת קצה הלשון. ואז להעביר רקמה ל 15 מיליליטר של הפתרון של Tyrode סטרילי טרי.

להפריד את האפיתל מרקמת החיבור הבסיסית בחלל subepithelial מעוכל האנזים באמצעות מספריים מיני לקצץ את הרקמות לגודל הנכון, על פי הדרישה של ניסויים במורד הזרם. שטפו את האפיתל המופרד ואת רקמת החיבור הבסיסית פעמיים ב-15 מיליליטר של הפתרון של Tyrode סטרילי טרי בצלחת תרבות של 100 מילימטר. להעביר את הרקמות לשלושה מיליליטר של 0.25%trypsin EDTA בצלחת תרבות חדשה 35 מילימטר.

דגירה את המנה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, בעדינות להתסיס את הרקמות כל חמש דקות עם טיפים פיפטה מיליליטר אחד. הוסף 500 מיקרוליטרים של 5%FBS ב- DMEM F12 כדי לעצור את התגובה ולהעביר את המדיום לצינור צנטריפוגה מחייב נמוך של חמישה מיליליטר. צנטריפוגה השעיית התא ב 200 פעמים G במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.

בעדינות resuspend התאים בשלושה מילימטרים של DMEM F12 המכיל 10%FBS ו 1%BSA, ולסנן את התאים עם מסננת תאים 70 מיקרומטר, ואחריו מסננת תאים 35 מיקרומטר. צנטריפוגה השעיית התא ב 200 פעמים G במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר את רוב המדיום, משאיר 50 עד 300 microliters כנפח הסופי כדי resuspend התאים. בלשון העכבר העוברי, ניתן לראות פער במרחב התת-דתי לאחר עיכול אנזים תקין.

בלשון העכבר הבוגר, הזרקת אנזים מוצלחת מסומנת על ידי נפיחות באזורים המוזרקים, מה שמרמז כי האנזים יכול להיות מוחזק על ידי הלשון. לאחר איגום יריעות האפיתל של E12.5 לשונות ושכבות דקות של mesenchyme, ספירת תאים ידנית הוכיחה כי הפרוטוקול הניב 63, 917 תאים בסך הכל עם הכדאיות של 95.2% מן גיליונות האפיתל, ו 294, 333 תאים בסך הכל עם הכדאיות של 96.3% מן mesenchyme. כאשר 10 לשונות מבוגרים בגיל שמונה שבועות שימשו, הפרוטוקול הניב 187, 333 תאים עם יכולת הקיום של 95.4% יריעות אפיתל של קצה הלשון, 544, 000 תאים עם יכולת הקיום של 96.3% יריעות אפיתל של papillae circumvallate, ו 150, 500 תאים עם הכדאיות של 93% מרקמות חיבור.

בעקבות פרוטוקול זה, ניתן להשתמש בתאים המנותקים לריצוף RNA של תא יחיד ולתרבות אורגנואידית לבדיקה תלת-ממדית כדי להגדיר תאי אב בדיקה לא מזוהים תחת האפיתל הלשונית.