Developmental Biology
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12.5日目および8週齢マウスの舌上皮・間分性/結合組織からの細胞解離
Chapters
Summary January 21st, 2021
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我々は、胚および成体マウス舌の上皮および間線質/結合組織から大量の高品質単一細胞を解離するための一般化されたプロトコルを開発した。
Transcript
複雑な組織からの細胞の高収率と品質は、単一細胞RNAシーケンシングや一次幹細胞培養など、一般的に使用される実験分析に不可欠です。このプロトコルは、舌上皮および結合組織を含む哺乳類舌の異なる領域および組織区画から高収率および品質で健康な細胞を生成する。上皮をE 12.5マウス舌の間質から分離するには、安楽死させた妊娠した雌マウスを手術領域に移し、70%エタノールでマウス腹部を濡らして毛皮が手術部位に入るのを防ぐ。
胚を運ぶ子宮の角を露出させるために解剖ハサミを使用して腹部を開き、子宮の角を解剖し、100ミリメートル培養皿で新鮮なタイロードの溶液の15ミリメートルにそれらを転送します。解剖顕微鏡の下で、子宮の角から胚を解剖するためにミニはさみと細かい鉗子を使用してください。細かい鉗子で口腔を開き、ミニハサミを使用して下顎から舌を解剖します。
100ミリメートルの培養皿で新鮮な滅菌タイロードの溶液の15ミリリットルで舌を洗います。その後、35ミリメートルの培養皿でジスパーゼとコラーゲンの酵素混合物の2ミリリットルに組織を移し、摂氏37度で20分間インキュベートします。舌を新鮮な滅菌タイローデの溶液の15ミリリットルに移し、細かい鉗子を使用して腹側から間質と上皮を穏やかに分離する。
分離した上皮と間質を15ミリリットルの新鮮な滅菌タイローデの溶液で2回洗います。舌上皮を成体マウスの下にある結合組織から分離するには、安楽死させたマウスを手術領域に移し、70%エタノールを使用してマウスヘッドを濡らして毛皮が口腔内に入るのを防ぐ。切除はさみを使用して頬に沿って口の角を切り取り、口腔を開きます。
下顎で舌を解剖し、それを洗い、ラップの層とプラスチック皿に入れます。手術用鉗子を使用して舌を保持し、後舌の最先端を通して舌の上皮下腔にディスパーゼとコラゲナーゼの酵素混合物を注入する。組織採取のために舌全体に酵素混合物を1ミリリットル均等に注入し、舌先端から組織採取のために前舌または後舌に0.5ミリリットルの酵素混合物を局所的に注入して、乳頭回りの組織コレクションを回る。
ラップで舌を包み、30分間摂氏37度でインキュベートします。乳頭と舌の先端の周りを解剖するためにミニはさみを使用してください。その後、新鮮な滅菌タイロードの溶液の15ミリリットルに組織を移す。
下流の実験の要件に従って、酵素消化下上皮空間の下層結合組織から上皮を分離し、適切なサイズに組織をトリミングします。分離した上皮と根底にある結合組織を100ミリメートル培養皿で15ミリリットルの新鮮な滅菌タイローデの溶液で2回洗浄します。新しい35ミリメートル培養皿で0.25%トリプシンEDTAの3ミリリットルに組織を移す。
30分間摂氏37度で30分間インキュベートし、1ミリリットルのピペットチップで5分ごとに組織を穏やかに攪拌します。DMEM F12に5%FBSの500マイクロリットルを加えて反応を停止し、培地を5ミリリットルの低結合遠心分離管に移します。細胞懸濁液を室温で8分間Gの200倍に遠心し、上清を取り除く。
10%FBSと1%BSAを含むDMEM F12の3ミリリットルの細胞を穏やかに再懸濁し、70マイクロメートルの細胞ストレーナーで細胞をフィルタリングし、続いて35マイクロメートルの細胞ストレーナーを続ける。細胞懸濁液を室温で8分間Gの200倍にして、培地の大部分を取り除き、最終的な体積として50〜300マイクロリットルを残して細胞を再懸濁させる。胚性マウス舌では、適切な酵素消化後に上皮下腔の隙間が見える。
成人マウス舌では、酵素注射が成功し、注入された領域の腫脹によって示され、これは酵素が舌によって保持され得ことを示唆している。E12.5舌の上皮シートと間葉系の薄い層をプールした後、手動細胞数は、プロトコルが上皮シートから95.2%の生存率を持つ合計で63、917細胞を生み出し、294、333細胞がメセンチムから96.3%の生存率を有することを実証した。8週齢で10個の成人舌を使用した場合、このプロトコルは、舌先端の上皮シートから95.4%の生存率を有する187、333個の細胞、乳頭周回の上皮シートから96.3%の生存率を有する544,000個の細胞、および93%の生存率を有する150,500細胞を生み出した。
このプロトコルに従って、解ciaciaされた細胞は、単一細胞RNAシーケンシングおよび3Dテストオルガノイド培養物に使用して、舌上皮下で認識されていない試験前駆細胞を定義することができる。
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