Cell dissociation från tungan Epitel och Mesenchyme/Bindväv av embryonal dag 12,5 och 8 veckor gamla möss

Hög avkastning och kvalitet på celler från komplexa vävnader är avgörande för vanlig experimentell analys, såsom RNA-sekvensering med en cell och primära stamcellskulturer. Detta protokoll genererar friska celler med hög avkastning och kvalitet från olika regioner och vävnadsfack på däggdjurstungan, inklusive tungan epitel och bindväv. För att separera epitelet från mesenkymen hos en E 12,5 mustunga, överför den avlivade gravida kvinnliga musen till operationsområdet och blöt mus buken med 70% etanol för att förhindra päls från att komma in i operationsplatsen.

Öppna buken med dissekerande sax för att exponera livmoderhornen som bär embryona, dissekera livmoderhornen och överför dem till en 15 milliliter färsk tyrods lösning i en 100 millimeters kulturrätt. Under ett dissekerande mikroskop, använd minisax och fina tångar för att dissekera embryona från livmoderhornen. Öppna munhålan med de fina tångarna och dissekera tungan från underkäken med minisaxen.

Tvätta tungorna med 15 milliliter färsk steril tyrodlösning i en 100 millimeters odlingsrätt. Överför sedan vävnaderna till två milliliter av en enzymblandning av dispas och kollagen i en 35 millimeters odlingsfat och inkubera i 20 minuter vid 37 grader Celsius. Överför tungorna till 15 milliliter färsk steril tyrods lösning och separera försiktigt mesenchymen och epitelet från ventralsidan med fina tångar.

Tvätta den separerade epitylen och mesenkymen två gånger i 15 milliliter färsk steril Tyrodes lösning. För att separera tungan epitel från den underliggande bindväven hos en vuxen mus, överför den avlivade musen till operationsområdet och blöt mushuvudet med 70% etanol för att förhindra päls från att komma in i munhålan. Använd dissekerande sax för att skära hörnen av munnen längs kinden för att öppna munhålan.

Dissekera tungan med en underställsmanöver, tvätta den och placera den i en plastform med ett lager plastfolie. Använd kirurgiska tång för att hålla tungan, injicera enzymblandningen av dispase och kollagenas i tungans subepithelialutrymme genom den bakre tungans skäregg. Injicera en milliliter enzymblandning jämnt på hela tungan för vävnadsuppsamling och injicera sedan 0,5 milliliter enzymblandning lokalt till den främre tungan för vävnadsuppsamling från tungspetsen eller till den bakre tungan för cirkumvallate papillavävnadssamling.

Linda tungan med plastfolie och inkubera den i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Använd minisax för att dissekera cirkumvallate papilla och tunga spets. Överför sedan en vävnad till 15 milliliter färsk steril Tyrodes lösning.

Separera epitelet från den underliggande bindväven i enzymet smält subepithelialutrymme med minisax och trimma vävnaderna till en korrekt storlek, enligt kravet på nedströmsexperiment. Tvätta det separerade epitelet och underliggande bindväv två gånger i 15 milliliter färsk steril Tyrodes lösning i en 100 millimeters odlingsskål. Överför vävnaderna till tre milliliter 0,25% trypsin EDTA i en ny 35 millimeters odlingsrätt.

Inkubera skålen i 30 minuter vid 37 grader Celsius och omrör försiktigt vävnaderna var femte minut med en milliliter pipettspetsar. Tillsätt 500 mikroliter med 5% FBS i DMEM F12 för att stoppa reaktionen och överföra mediet till ett fem milliliter lågt bindande centrifugerör. Centrifugera cellupphängningen vid 200 gånger G i åtta minuter vid rumstemperatur och ta bort supernaten.

Återanvänd cellerna försiktigt i tre milliliter DMEM F12 som innehåller 10% FBS och 1%BSA och filtrera cellerna med en 70 mikrometer cellsil, följt av en 35 mikrometer cellsil. Centrifugera cellupphängningen vid 200 gånger G i åtta minuter vid rumstemperatur och ta sedan bort det mesta av mediet och lämna 50 till 300 mikroliter som den slutliga volymen för att återanvända cellerna. I den embryonala mustungan är en lucka i det subepitheliala utrymmet synlig efter korrekt enzymsmältning.

I den vuxna mustungan indikeras en framgångsrik enzyminjektion genom svullnad i de injicerade områdena, vilket tyder på att enzymet kan hållas av tungan. Efter poolning av E12,5 tungor epitelial ark och tunna lager av mesenchyme, manuell cellräkning visat att protokollet gav 63, 917 celler totalt med en livskraft på 95,2%från epitelial ark och 294, 333 celler totalt med en livskraft på 96,3%från mesenchyme. När 10 vuxna tungor vid åtta veckors ålder användes, protokollet gav 187, 333 celler med en livskraft på 95,4%från epitelial ark av tungan spetsen, 544, 000 celler med en livskraft på 96,3%från epitelial ark av circumvallate papillae och 150, 500 celler med en livskraft på 93%från bindväv.

Efter detta protokoll kan de dissocierade cellerna användas för RNA-sekvensering med en cell och 3D-testorganoidkultur för att definiera okända testprogenitorceller under det linguala epitelet.