Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kemisk dimerisering-induceret protein kondensater på telomerer
Chapters
Summary April 12th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol illustrerer et kemisk induceret protein dimerization system til at skabe kondensater på kromatin. Dannelsen af promyelocytic leukæmi (PML) nukleare organ på telomerer med kemisk dimerizers er demonstreret. Dråbevækst, opløsning, lokalisering og sammensætning overvåges med levende cellebilleddannelse, immunofluorescence (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH).
Transcript
Denne protokol beskriver det kemiske dimeriseringssystem for at fremkalde proteinkondenater på telomerer. Det kan let tilpasses til at fremkalde kondensater på andre genomiske loci, og er velegnet til sondering dannelsen og funktionen af kromatin tilknyttede kondensater. Denne metode tilbyder tidsmæssig opløsning, der kræves til levende cellebilleddannelse og opretholder faseadskillelse i populationen af celler til biokemiske analyser.
Til at begynde med opløses dimerizers i DMSO ved 10 millimolar og opbevar dem i plastmikrocentrifugerør ved minus 80 grader Celsius til langtidsopbevaring. Fortynd en aliquot på 10 millimolar dimerizer i billedbehandling medium til en bestand koncentration på 10 mikromolar og gemme det på minus 20 grader Celsius. Når du er klar til brug, fortyndes dimerizers til en endelig arbejdskoncentration på 100 nanomolar i vækstmedium eller billedmedie.
Seed 10 til de femte celler i 12 millimeter diameter cirkulære dækglas belagt med Poly-D-Lysin i en seks-brønd plade. Transfect derefter cellerne med Halo-GFP-TRF1 og mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDFR-SIM mutant plasmids og vent i 24 til 48 timer, før du fortsætter med at immunofluorescence. Tilsæt de fortyndede 100 nanomolar dimerizers til cellerne og inkuber dem i 37 grader Celsius i fire til fem timer.
Efter inkubationen skal cellerne i PBS-opløsning indeholdende 4% formaldehyd og 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur for at permeabilisere cellerne. Vask derefter cellerne tre gange med PBS. Vaskedækslet glider to gange med 50 mikroliter TBS-Tx og en gang med 50 mikroliter antistoffortyndingsbuffer.
Inkuber hvert dæksel med 50 mikroliter af primær anti-PML, anti-SUMO-1 eller anti-SUMO-2 og 3 antistof ved fire grader Celsius i et befugtet kammer natten over. Vaskedækken glider tre gange med antistoffortyndingbuffer for at fjerne ubundet primært antistof og inkuberer derefter cellerne med sekundært antistof i en time i en mørk boks ved stuetemperatur. Efter farvning glider vaskedækslet tre gange med TBS-Tx.
Label slides ved at tilføje to mikroliter af et mikrogram per milliliter DAPI, derefter flip dækslet glider over og placere dem på DAPI drop. Aspirere ekstra væske fra kanten af dækslet slip. Forsegl rutsjebanen med neglelak, lad den tørre, og skyl toppen af dækslet slip med vand.
Placer diasene i fryseren, indtil de billeddannelser. Seed 10 til de femte celler på 12 millimeter cirkulære dækbriller belagt med Poly-D-Lysin i en seks-brønd plade og transfect dem med Halo-TRF1 og mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM mutant plasmids. Fix cellerne med 4% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og vask dem fire gange med PBS.
For IF-FISH skal cellerne pletters med primære og sekundære antistoffer og anbringe dem med 4% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, derefter vaske dem fire gange med PBS og dehydrere dækslerne i en ethanolserie. Inkuber dækslet glider med 488 telomere C-PNA sonde i fem mikroliter af hybridisering opløsning ved 75 grader Celsius i fem minutter, derefter inkubere dækslet glider natten over i et befugtet kammer ved stuetemperatur. Vask dækslet glider tre gange med vaskebuffer i to minutter pr. vask ved stuetemperatur, og monter dem med et mikrogram pr. milliliter DAPI i monteringsmedier til billeddannelse.
For levende billeddannelse, montere dækslet glider i magnetiske kamre på et opvarmet stadium i et miljøkammer, opretholde cellerne i en milliliter billeddannelse medium uden phenol rød. Opsætning af mikroskop- og miljøkontrolapparatet som beskrevet i tekstmanuskriptet. Find celler med et lyst GFP-signal på telomererne og diffusivt mCherry-signal i cytosolen.
Find omkring 20 celler, udenad hver position med XYZ-oplysningerne, og konfigurer parametre for time-lapse-billeddannelse. Brug 0,5 mikrometerafstand til i alt otte mikrometer i Z og fem minutters tidsinterval i to til fire timer for både GFP- og mCherry-kanaler. Brug 30 % af 594 nanometer og 50 % af 488 nanometereffektintensitet med eksponeringstider på 200 millisekunder og en kameraforøgelse på 300.
Start billeddannelse og tage én gang loop som pre-dimerization. Sæt derefter billeddannelsen på pause, tilføj 0,5 milliliter billedmedier, der indeholder 15 mikroliter af 10 mikromolar dimerizer til billedbehandlingskammeret, idet du sørger for ikke at røre scenen og genoptage billeddannelse. Når du er klar til at vende dimerisering, pause billeddannelse og tilføje 0,5 milliliter billedbehandling medier, der indeholder to mikroliter af 100 millimolar lager TMP til billedbehandling kammer.
Fortsæt med at billeddanne cellerne i en til to timer. For fast billeddannelse skal du bruge den samme mikroskopopsætning som live imaging, men uden sceneopvarmning. Find omkring 30 til 50 celler med det røde signal til at vælge for transfected celler.
Indshent billeder med 0,3 mikrometerafstand for i alt otte mikrometer i Z.Use 80% af 647 nanometer, 80% af 561 nanometer og 70% af 488 nanometer effektintensitet, med eksponeringstider på 600 millisekunder og en kameragevinst på 300. Telomerisk lokalisering af SUMO blev identificeret ved hjælp af telomere DNA FISH og SUMO protein immunofluorescence. Celler med SIM rekruttering beriget SUMO-1 og SUMO-2 og 3 i forhold til celler med SIM mutant rekruttering, hvilket indikerer, at SIM dimerization induceret SUMO berigelse på telomerer afhænger af SUMO-SIM interaktioner.
En time-lapse film af TRF-1 og SIM efter dimerization vises her. SIM blev med succes rekrutteret til telomerer, og både SIM og TRF-1 foci blev større og lysere, som forudsagt for flydende dråbedannelse og vækst. Derudover blev fusion af TRF-1 foci observeret, hvilket førte til telomere klyngedannelse, som vist i det reducerede telomeretal og øget telomereintensitet over tid.
I modsætning hertil blev SIM mutant rekrutteret til telomerer efter dimerization, men ikke fremkalde nogen dråbedannelse eller telomere klyngedannelse, hvilket indikerer, at fase adskillelse og telomere klyngedannelse er drevet af SUMO-SIM interaktioner. Tilbageførsel af faseadskillelse og telomereklynger blev observeret efter tilsætning af overskydende gratis TMP. Telomeretallet steg, og telomerintensiteten faldt over tid.
Repræsentative billeder af APBs identificeret ved telomere DNA FISH og PML protein IF er vist her. Celler med SIM rekrutteret har flere APBs end celler med SIM mutant rekrutteret, tyder dimerization induceret kondensater er faktisk APBs. Når du udfører denne protokol, må du ikke udsætte lysfølsomme dimerizers for lys.
Arbejd i et mørkt rum med en lampe, der udsender rødt lys og wrap celler med aluminiumsfolie under inkubation. Efter denne procedure kan nærhedsmærkning bruges til at generere en omfattende liste over komponenter i det inducerede kondensat. Live imaging kan bruges til at følge dynamikken i komponenter i kondensatet.
Disse metoder kan hjælpe med at bestemme rollerne for styring af kondensatsammensætningskontrol.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
