在囊性纤维化肺中的伪肌瘤和金黄色葡萄球菌生物膜的前体内模型中进行抗生素疗效测试

这种方法允许你在一个环境中生长细菌，触发类似的细胞生理学和生物膜形态学，你看到囊性纤维化肺感染。肺是肉类行业的废物，所以没有道德问题。该模型提供了一个平台，可以模拟人类感染，而无需活的动物模型。

这项技术为研究人员提供了一种新的方法来筛选候选药物，以寻找进入和破坏囊性纤维化肺中形成的生物膜的可能性。随着进一步发展和验证，我们相信EVPR模型可能可用于专门和个性化的抗生素易感性测试。屠宰后立即获得肺部，并将其运送到国内冷箱中的实验室。

在消毒表面和火焰下工作。将肺放在一个干净的塑料切菜板上，上面覆盖着高压铝箔，并检查支气管是否完好无损。如果屠宰场或运输过程中有任何损坏，则肺不适合使用。

在火焰下加热托盘刀，并非常短暂地触摸刀到支气管周围的肺部区域，以消毒组织表面。使用无菌安装的剃须刀刀片切割支气管周围的表面组织，使切口与支气管平行，以防止任何损坏。一旦支气管暴露出来，在可见的最高点通过支气管切口。

使用无菌钳子，轻轻握住支气管的任意端，使用无菌安装的剃须刀刀片切割任何剩余的不需要的组织。在可见任何分支从肺中取出支气管之前，在支气管上做最后的横截面切口。将支气管放在第一个DMEM RPMI 1640洗涤中。

将其留在洗涤中，从同一肺中收获支气管的其他部分，以产生足够的组织部分，用于计划中的实验。将同一肺部的任何额外支气管部分放入洗涤中，并将其洗涤至少两分钟。从第一次洗涤中取出支气管，并将样品放在无菌的培养皿中。

用无菌钳子轻轻握住每个支气管，注意不要损坏组织。尽可能多地取出剩余的软组织，用无菌解剖剪刀将组织切成五毫米宽的条状。将所有支气管组织条放入第二个 DMEM RPMI 1640 洗涤中。

将它们放在洗涤中至少两分钟，然后使用无菌钳从第二次洗涤中取出组织条，并将其放在干净、无菌的培养皿中。取出连接到支气管的任何剩余软组织，并用无菌解剖剪刀将条切成正方形。将第三个 DMEM RPMI 1640 洗涤剂添加到培养皿中，然后通过旋转盘轻轻混合洗涤中的组织件。

将第三次洗净从培养皿中倒出，而不去除组织件。然后添加最后的SCFM洗涤，确保覆盖所有组织件。在紫外线下对 SCFM 中的组织进行消毒五分钟。

使用无菌钳将每个消毒支气管组织片转移到含有 SCFM agarose 垫的 24 井板的单独井中。要用所需的细菌菌株感染每个组织片，触摸生长在 agar 板上的菌落，用 29 量表针尖连接到无菌的 0.5 毫升胰岛素注射器上，然后触摸菌落到组织片上，轻轻刺破表面。对于未受感染的控制，用针尖轻轻刺破组织件的表面，然后使用移液器向每口井添加 500 微升 SCFM。

在紫外线下，为每24个井板消毒透气密封膜10分钟。从 24 井板中取出盖子，用透气膜代替，然后在 37 摄氏度下孵化板，无需摇晃。设置至少两个独立肺部的复制组肺片，使用一组进行负对照，每组抗生素各一组进行测试。

经过48小时的潜伏，目视检查未受感染的组织片段，以发现内源性细菌的生长，这会导致这些部分周围的介质浑浊。如果观察到所选研究物种的典型生长，请重新开始使用新鲜肺的实验。如果未受感染的组织部分显示没有或最小的细菌生长，准备一个24井洗盘和一个24井处理板。

处理板的每口井应含有500微升的新鲜SCFM，无需抗生素，或与感兴趣的抗生素。用火焰消毒钳从孵化板中取出每个受感染的组织片。在洗盘的新鲜井中短暂旋转，以去除任何非生物膜相关细菌细胞，并将其转移到处理板的适当井中。

用新鲜的透气膜密封处理板，然后在37摄氏度下孵育，无需摇晃18至24小时。使用火焰消毒钳从24井板中取出每个肺片，并将其放入无菌的两毫升均质管中，其中含有一毫升PBS和一克金属珠。珠子以每秒四米的速度跳了40秒。

使用 PBS 连续稀释肺同质化，并在 LB agar 上贴板，以确定单独、未经治疗和抗生素治疗的组织件中的结肠形成单位。当生长在前活猪肺或EVPL时，P.aeruginosa和S.aureus的生物膜表明，与标准、行业认可的肉汤MIC和使用标准介质的磁盘检测的易感性相比，对抗生素的耐受性更强。不同抗生素对EVPL建立的生物膜的各种影响是可区分的。

例如，P.aeruginosa 的杀伤是在 EVPL 中实现的，其 4 到 16 倍 MIC 丙氟沙辛，但 4 到 8 倍 MIC 氯霉素的杀伤力则不行。在磁盘测定中易受线佐利德影响的金黄色葡萄球菌种群能够在目标血清浓度和 EVPL 中存活。即使是优化的体外检测也不能准确预测 EVPL 中的 P.aeruginosa 易感性。

实现 EVPL 生长细菌的三次日志 10 杀灭所需的抗生素量通常明显高于根据标准体外检测计算的 MIC 或 MBEC。除了区分抗微生物剂之间的差异外，该模型还可以突出不同细菌生长阶段和不同抗生素服用间隔的易感性变化。此处显示了 P. aeruginosa 生物膜在成熟时对梅罗佩内姆的耐受性越来越高。

在接触氟氯沙辛后4小时和24小时测量了金黄色葡萄球菌的存活率，从而能够观察到在时间和孤立物之间减少细菌细胞计数的差异。细菌负荷的变化往往随着培养时间的延长而增加。这在48小时生物膜开发和24小时接触抗生素给药间隔的未治疗控制中可见一斑。

在整个解剖过程中保持出色的无菌技术至关重要，因此我们建议在实验室或实验室的一个区域进行解剖，而您从未用于微生物学工作。我们最近利用该模型探索了柯利斯汀进入生物膜的入口，该模型在研究中具有很好的应用潜力，可改善生物膜中的药物输送。