In vivo Kalsiumavbildning i musen dårligere oliven

Dårligere oliven er den mest ventrale delen av medulla, og er dermed ekstremt vanskelig å nå i et levende dyr. Her introduserer vi en protokoll for å eksponere den voksne musehjernen fra ventralsiden, og bruke GRIN-linser til å registrere nevronaktivitet i de dårligere olivennevronene som uttrykker kalsiumsensorer. Denne metoden unngår skade på livskritisk hjernestamme, og muliggjør undersøkelser av romlige-temporale aktivitetsmønstre og inngangsintegrasjon i den dårligere oliven.

Siden operasjonen utføres i den komplekse halsregionen med mange vitale strukturer, er det viktig at den utføres av en forsker med høye kirurgiske ferdigheter. Forbered et intubasjonsrør ved å kutte en 5 til 6 millimeter lang og 0,8 millimeter bred spalte fra spissen av et 20 gauge kateter. Forbered en stump og buet nål ved å kutte spissen av, slip bruddoverflaten og bøy den med tangen.

Dette vil bli brukt til å støtte en luftrør under trakeotomi. Fortynn 15 milligram per milliliter ketamin med saltvann til 15% Monter kirurgiverktøy og forbruksvarer. Sett varmeputen til 38 grader Celsius.

Drei nosecone 180 grader horisontalt i stereotaxisk ramme. Vei musen hvis dårligere oliven tidligere ble transfektert av virusbærende GCaMP6s, og beregn mengden fortynnet ketamin til injeksjon. Forhåndsutfyll induksjonsboks med 5 % isofluran, og bedøv musen.

Monter musen i den stereotaktiske rammen, ventral side opp. Barber musestrupen og lårområdet. Fjern gjenværende hår med hårfjerningskrem.

Topisk påfør xylocaine gelé på halshuden. Overvåk musetemperaturen med en rektal termisk sensor. Injiser en milliliter forvarmet saltvann intraperitoneally.

Vurder dybden av anestesi ved sterk klemme på bakbenet tær. Ingen påviselig respons bør fremkalles. Lag et vertikalt snitt i halshuden langs midtlinjen.

Skill nakkehuden fra viscera under den ved hjelp av stump disseksjonsmetode og kutt av huden. Gratis spyttkjertler fra bindevev, og snu dem lateralt for å eksponere sternothyroid muskeldekket luftrør. Injiser intraperitoneally den første dosen fortynnet ketamin ved fem milliliter per kilo dyrevekt.

Del forsiktig sternothyroidmuskelen langs midtlinjen med spissen av en fin tang for å eksponere luftrøret. Løsne luftrøret fra blodårene og spiserøret med tang ved hjelp av stump disseksjonsmetode. Injiser en ny dose fortynnet ketamin ved 2,5 milliliter per kilo dyrevekt.

Sett inn en stump nål under luftrøret på tvers. Løft luftrøret med den stumpe nålen. Få suturtråden til å gå rundt den tredje luftrøret, kaudal skjoldbruskkjertelen, med en halv sirkel nål.

Lag fire instrumentbånd på denne ringen. Pierce brysthuden med samme halvsirkel nål og lede tråden gjennom huden. Løft luftrøret forsiktig med tråden, og kutt luftrøret caudal til skjoldbruskkjertelen.

Trekk luftrøret mot brysthuden. Løft åpningen av luftrøret ved å legge til et lite stykke kirurgisk svamp under den. Fjern eventuell gjenværende væske inne i åpningsspissen av luftrøret med en tynn stripe med rengjøringsvev.

Bytt isofluranstrømmen fra stereotaxisk nosecone til intubasjonsrøret. Sett intubasjonsrøret inn i luftrøret. Pass på at en del av spalten i røret forblir utenfor luftrøret for å tillate innånding.

Fest luftrøret til musen brysthud ved å lage tre til fire instrumentbånd. Bind luftrøret med suturtråden for å feste intubasjonsrøret. Slit sternothyroid muskelen langs muskelfibrene med fine tang.

Klipp den isolerte delen av med vårsaksen. Forsiktig fri rester luftrør og strupehode fra muskel for å minimere skaden på blodårene i muskelen. Fjern rester av luftrør og strupehode.

Frigjør spiserøret fra vedlagt vev med tang og kutt det av med vårsaks. Fjern langsgående muskel som dekker hjernestammen og atlasets ventrale bue. Fjern muskelen som dekker atlas ventralbuen og det fremre tuberkelet.

Klipp ventralbuene av atlas med rongeuren. Fjern det fremre tuberkelet av atlas. Fjern blod og væske for å se foramen magnum og hjernestammen.

Utvid foramen magnum ved å fjerne occipital bein med rongeur. Fjern brusk, og skrell forsiktig det periosteale laget av dura mater med de fine tangene for å ha en klar utsikt over ventral hjernestamme. Klem SpO2-sensoren på låret på musen for å overvåke vitale tegn som hjertefrekvens, oksygenmetning og pustefrekvens.

Monter GRIN-objektivet på implantasjonsstangen. Rengjør linsen forsiktig med 70% etanol-gjennomvåt rengjøringsvev. Fest implantasjonsstangen på stereotaxisk ramme og monter miniatyrmikroskopet på implantasjonsstangen.

Tilsett flere dråper saltvann i hjernestammeområdet for nedsenking av GRIN-linsen. Tilnærm hjernestammen med GRIN-linsen. GCaMP6s som uttrykker dårligere olivennevroner i det overfladiske området, finnes i et rektangelformet område, ca 0,5 til 1,7 millimeter rostral til det gjenværende atlaset, og ca 2,6 til 1,1 millimeter lateral til midtlinjen.

Slå på eksitasjonsblå LED i miniatyrmikroskop for å finne GCaMP6s transfekterte dårligere olivennevroner. Nevronene viser forskjellig baseline fluorescensintensitet på grunn av ulike GCaMP6s uttrykksnivå. Endringen av kalsiumnivå av sirklet dårligere oliven neuron somata i videoen til venstre vil vise oss delta F delt av F spor til høyre.

Selv om musen holdes varm og hydrert, vil den uunngåelig bli svekket av langvarig anestesi og kirurgi. Det er viktig å holde varigheten av operasjonen kort slik at musens fysiske tilstand vil være bra for opptak. En dyktig forsker kan fullføre operasjonen på 70 minutter.

Denne metoden, med modifikasjoner, kan brukes til å studere andre tilstøtende regioner i ventral hjernestammen.