This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In vivo Кальций Изображения в мыши Нижняя Оливковая
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Мы представляем протокол, чтобы разоблачить ствол мозга взрослой мыши с брюшной стороны. С помощью градиентно-рефракционного индексного объектива с миниатюрным микроскопом, кальций изображения могут быть использованы для изучения активности нижней оливковой нервной сомата in vivo.
Transcript
Нижняя оливка является наиболее брюшной частью медуллы, и, таким образом, чрезвычайно трудно достичь в живом животном. Здесь мы вводим протокол, чтобы разоблачить мозг взрослой мыши стволовых от брюшной стороны, и использовать линзы GRIN для записи нейронной активности в нижних оливковых нейронов, выражаюющих датчики кальция. Этот метод позволяет избежать повреждения критически важного для жизни ствола мозга, а также позволяет проводить исследования пространственно-временных моделей активности и входной интеграции в нижняя оливка.
Так как операция проводится в сложной области горла со многими жизненно важными структурами, важно, чтобы она проводится исследователем с высоким уровнем хирургических навыков. Подготовьте иноатную трубку, разрезая прорезь длиной от 5 до 6 миллиметров и шириной 0,8 миллиметра с кончика 20-го калибровного катетера. Подготовь тупую и изогнутую иглу, отрезав кончик, отшлифовав поверхность перелома и согните ее плоскогубцами.
Это будет использоваться для поддержки трахеи во время трахеотомии. Разбавить 15 миллиграмм на миллилитр кетамина с солевым раствором до 15%Собрать хирургические инструменты и расходные материалов. Установите грелку до 38 градусов по Цельсию.
Поверните nosecone 180 градусов горизонтально в стереотаксисной раме. Взвесьте мышь, чья нижняя оливка ранее была трансфицирована вирусосущей GCaMP6s, и рассчитать количество разбавленного кетамина для инъекций. Предварительно заполнить индукционный ящик с 5%isoflurane, и анестезировать мышь.
Намонтайте мышь в стереотаксисной раме, вентраль стороной вверх. Бритье мыши горла и бедра области. Удалите остаточные волосы кремом для удаления волос.
Местно нанесите ксилокаин желе на кожу горла. Мониторинг температуры мыши с помощью ректального теплового датчика. Ввимите один миллилитр предварительно разогретый солевой интраперитонически.
Оцените глубину анестезии сильным щепоткой на задних лапах. Не следует вызывать никаких обнаруживаемых ответов. Сделайте вертикальный разрез в коже горла вдоль средней линии.
Отделить кожу шеи от внутренностей под ним с помощью метода тупого вскрытия и отрезать кожу. Бесплатные слюнные железы из соединительной ткани, и перевернуть их сбоек, чтобы разоблачить стернотиреоидных мышц покрытых трахеей. Интраперитонально вводят первую дозу разбавленного кетамина по пять миллилитров на килограмм веса животного.
Тщательно разделить стернотиреоид мышцы вдоль средней линии с кончиком тонкой типсов подвергать трахеи. Отсоедините трахею от кровеносных сосудов и пищевода с помощью типсов с помощью метода тупого вскрытия. Ввимите вторую дозу разбавленного кетамина при 2,5 миллилитрах на килограмм веса животного.
Поперечно вставьте тупую иглу под трахею. Поднимите трахею тупой иглой. Сделать шов нить идти вокруг третьего кольца трахеи, caudal щитовидной железы, с половиной круга иглы.
Сделайте четыре инструментальных галстука на этом кольце. Пирс груди кожи с той же иглой полукруг и привести нить через кожу. Аккуратно поднимите трахею нитью и вырежьте трахею хвостом к щитовидной железе.
Потяните трахею к коже груди. Поднимите отверстие трахеи, добавив небольшой кусочек хирургической губки под ним. Удалите оставшуюся жидкость внутри открывающейся кончика трахеи тонкой полоской чистящих тканей.
Переключите изофлюранный поток из стереотаксийного носовогоона в инубную трубку. Вставьте инобубную трубку в трахею. Убедитесь, что часть щели в трубке остается за пределами трахеи, чтобы дышать.
Исправить трахеи для мыши груди кожи, сделав три-четыре инструмента связей. Свяжите трахею с шовной нитью, чтобы обеспечить иноподабительный трубки. Разрежьте стернотиреоидную мышцу вдоль мышечных волокон с помощью тонких типсов.
Отрежьте изолированную часть с ножницами весны. Тщательно освободите остатки трахеи и гортани от мышц, чтобы свести к минимуму повреждение кровеносных сосудов в мышцах. Удалите остатки трахеи и гортани.
Освободите пищевод от прикрепленной ткани с типсами и отрежьте его весенними ножницами. Удалите продольную мышцу, покрывающую ствол мозга и вентраловую арку атласа. Удалите мышцы, покрывающие атласную вентрал арку и переднюю клубень.
Вырезать вентрал арки атласа с rongeur. Удалите переднюю клубень атласа. Удалите кровь и жидкость для просмотра foramen magnum и ствол мозга.
Расширьте foramen magnum путем извлекать затылчной костоно с rongeur. Удалите хрящ, и тщательно очистить периостейный слой dura mater с тонкой тибры, чтобы иметь четкое представление о брюшной ствол мозга. Зажим датчик SpO2 на бедре мыши для мониторинга жизненно важных признаков, таких как частота сердечных сокращений, насыщение кислородом, и частота дыхания.
Намонтировать объектив GRIN на имплантативной штанге. Тщательно очистите объектив 70%-ной тканью очистки, пропитанной этанолом. Зафиксировать имплантатный стержень на стереотаксисной раме и установить миниатюрный микроскоп на имплантативный стержень.
Добавьте несколько капель солевого раствора в область ствола мозга для погружения в объектив GRIN. Подойди к стволу мозга с помощью объектива GRIN. GCaMP6s, выражающих нижние оливковые нейроны в поверхностной области, можно найти в области прямоугольной формы, от 0,5 до 1,7 миллиметра рострального к оставшемуся атласу, и от 2,6 до 1,1 миллиметра боковой к средней линии.
Включите возбуждение синий светодиод в миниатюрном микроскопе, чтобы найти GCaMP6s трансфицированных нижних оливковых нейронов. Нейроны показывают различную базовую интенсивность флуоресценции из-за различных уровней экспрессии GCaMP6s. Изменение уровня кальция кружили нижней оливкового нейрона сомата в видео слева будет показано нам дельта F разделены F следы справа.
Хотя мышь хранится теплой и увлажненной, она неизбежно будет ослаблена длительной анестезией и хирургией. Важно, чтобы сохранить продолжительность операции короткий так мыши физическое состояние будет хорошо для записи. Квалифицированный исследователь может закончить операцию за 70 минут.
Этот метод, с модификациями, может быть использован для изучения других смежных областей брюшной ствол мозга.
Tags
Нейронаука выпуск 172 Неврология нижняя оливка in vivo инъекция кальций изображения медулла мышьRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
