In vivo Kalciumavbildning i mus underlägsen oliv

Sämre oliv är den mest ventrala delen av medullan, och är därför extremt svår att nå i ett levande djur. Här introducerar vi ett protokoll för att exponera den vuxna mushjärnan från ventralsidan och använder GRIN-linser för att registrera neuronal aktivitet i de sämre olivneuronerna som uttrycker kalciumsensorer. Denna metod undviker skador på livskritisk hjärnstam och möjliggör undersökningar av rumsliga-temporala aktivitetsmönster och ingångsintegration i den sämre oliv.

Eftersom operationen utförs i den komplexa halsregionen med många vitala strukturer är det viktigt att den utförs av en forskare med kirurgiska färdigheter på hög nivå. Förbered ett intuberingsrör genom att skära en 5 till 6 millimeter lång och 0,8 millimeter bred slits från spetsen på en 20-gauge kateter. Förbered en trubbig och böjd nål genom att skära av spetsen, slipa frakturytan och böja den med tången.

Detta kommer att användas för att stödja en luftstrupe under trakeotomin. Späd 15 milligram per milliliter ketamin med saltlösning till 15% Montera operationsredskap och förbrukningsvaror. Ställ in värmedynan på 38 grader Celsius.

Vrid noskonen 180 grader horisontellt i stereotaxisk ram. Väg musen vars sämre oliv tidigare transfekterades av virusbärande GCaMP6s och beräkna mängden utspädd ketamin för injektion. Förfyllning av induktionslåda med 5%isofluran och söv musen.

Montera musen i stereotaxisk ram, ventral sida upp. Raka mushalsen och lårområdet. Ta bort det återstående håret med hårborttagningskräm.

Applicera xylocaine gelé på halsen huden. Övervaka mustemperaturen med en rektal termisk sensor. Injicera en milliliter förvärmd saltlösning intraperitoneally.

Utvärdera anestesidjupet genom stark nypa på bakbenst tårna. Inget detekterbart svar bör framkallas. Gör ett vertikalt snitt i halshuden längs mittlinjen.

Separera nackhuden från inälvorna under den med hjälp av trubbig dissekeringsmetod och skär av huden. Fria salivkörtlar från bindväv, och vända dem i lydnad för att exponera sternothyroid muskel-täckta luftstrupe. Intraperitoneally injicera den första dosen av utspädd ketamin vid fem milliliter per kilo djurvikt.

Dela försiktigt sternothyroid muskeln längs mittlinjen med spetsen av en fin tång för att exponera luftstrupe. Lossa luftstrupen från blodkärl och matstrupe med tång med trubbig dissekeringsmetod. Injicera en andra dos utspädd ketamin vid 2,5 milliliter per kilo djurvikt.

Sätt in en trubbig nål i sidled under luftstrupen. Lyft luftstrupen med den trubbiga nålen. Få suturtråden att gå runt den tredje luftstrupsringen, caudal sköldkörteln, med en halvcirkelnål.

Gör fyra instrumentband på den här ringen. Genomborra brösthuden med samma halvcirkelnål och led tråden genom huden. Lyft försiktigt luftstrupen med tråden och skär luftstrupen caudal till sköldkörteln.

Dra luftstrupen mot brösthuden. Höj luftstrupens öppning genom att tillsätta en liten bit kirurgisk svamp under den. Ta bort eventuell kvarvarande vätska inuti luftstrupens öppningsspets med en tunn remsa rengöringsvävnad.

Växla isofluranflödet från stereotaxisk noskon till intuberingsröret. För in intuberingsröret i luftstrupen. Se till att en del av slitsen i röret förblir utanför luftstrupen för att tillåta andning.

Fäst luftstrupen på mushuden genom att göra tre till fyra instrumentband. Bind luftstrupen med suturgängan för att säkra intuberingsröret. Skär sternothyroid muskeln längs muskelfibrerna med de fina tångarna.

Skär av den isolerade delen med fjädersaxen. Fritt överbliven luftstrupe och struphuvud från muskler för att minimera skadorna på blodkärlen i muskeln. Ta bort överbliven luftstrupe och struphuvud.

Fri matstrupe från fäst vävnad med tång och skär av den med fjädersax. Ta bort den längsgående muskeln som täcker hjärnstammen och atlasens ventrala båge. Ta bort muskeln som täcker atlas ventrala bågen och den främre tuberkeln.

Skär atlasens ventrala bågar med rongeuren. Ta bort atlasens främre rör. Ta bort blod och vätska för att se foramen magnum och hjärnstammen.

Expandera foramen magnum genom att ta bort occipital ben med rongeur. Ta bort brosket och skala försiktigt det periosteala lagret av dura mater med de fina tångarna för att ha en klar bild av ventral hjärnstammen. Kläm fast SpO2-sensorn på musens lår för att övervaka vitala tecken som hjärtfrekvens, syremättnad och andningshastighet.

Montera GRIN-linsen på implantationsstången. Rengör linsen noggrant med 70% etanolindränkt rengöringsvävnad. Fixera implantationsstången på stereotaxisk ram och montera miniatyrmikroskopet på implantationsstången.

Tillsätt flera droppar saltlösning i hjärnstammen för nedsänkning av GRIN-linsen. Närma dig hjärnstammen med GRIN-linsen. GCaMP6s uttrycker sämre olivneuroner i det ytliga området kan hittas i en rektangelformad region, ca 0,5 till 1,7 millimeter rostral till den återstående atlasen och ca 2,6 till 1,1 millimeter laterala till mittlinjen.

Slå på excitationsblå lysdioden i miniatyrmikroskop för att hitta GCaMP6s transfekterade underlägsna olivneuroner. Nervcellerna visar olika baslinje fluorescens intensitet på grund av olika GCaMP6s uttryck nivå. Förändringen av kalciumnivån av inringade sämre olivneuron somata i videon till vänster kommer att visa oss delta F dividerat med F-spår till höger.

Även om musen hålls varm och hydratiserad, kommer den oundvikligen att försvagas av långvarig anestesi och kirurgi. Det är viktigt att hålla operationens varaktighet kort så att musens fysiska tillstånd blir bra för inspelning. En skicklig forskare kan avsluta operationen på 70 minuter.

Denna metod, med modifieringar, kan användas för att studera andra angränsande regioner i ventral hjärnstammen.