Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Levering af Cas9/sgRNA Ribonukleoproteinkomplekset i udødeliggjorte og primære celler via viruslignende partikler ("nanoblade")
Chapters
Summary March 31st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi har udviklet en enkel og billig protokol til at indlæse Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteinkomplekser i viruslignende partikler. Disse partikler, kaldet "Nanoblades", muliggør effektiv levering af Cas9 / sgRNA-komplekset i udødeliggjorte og primære celler såvel som in vivo.
Transcript
Nanoblades tillod hurtig, effektiv og dosisafhængig levering af Cas9- og guide-RNA-komplekset, både i udødeliggjorte og i primære celler og i fravær af antitransgen. Den største fordel ved denne metode er, at nanoblade er nemme og relativt billige at forberede. De kan levere Cas9- og styre RNA-komplekset på en dosisafhængig og forbigående måde og dermed begrænse off-target-effekter, samtidig med at de giver mulighed for effektiv genomredigering.
Forberedelsesprotokollen for nanoblade er meget enkel. Kvaliteten af producentcellerne såvel som deres oprindelse og deres såning før transfektion er imidlertid afgørende for at opnå høje udbytter af viruslignende partikler. Laura Guiguettaz, en ingeniør fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren.
På dag et frø 3,5 til 4 millioner HEK 293T celler i 10 ml modificeret DMEM og penicillin streptomycin i en 10 centimeter cellekultur skål. Efter 24 timer, når cellerne når 70% sammenløb, skal du udskifte medium med frisk DMEM og bruge en P-1000-pipette til at tilføje transfektionsreagensopløsning på en dråbevis måde. Begynd at høste nanoblade på dag fire ved at samle kulturmediet supernatant med en 10 ml pipette.
Det er normalt, at kulturmediets farve bliver gul på dette stadium. Centrifugering af det opsamlede supernatant ved 500 G i fem minutter for at fjerne cellulært affald og genvinde ni milliliter af supernatanten uden at forstyrre cellepillen. Pellet nanobladene i en ultracentrifuge ved 209.490 G i 75 minutter ved fire grader Celsius.
Efter centrifugering aspirerer mediet langsomt og suspenderer den hvide pellet igen med 100 mikroliter kold PBS. Dæk røret med parafilm og inkuber i en time ved fire grader Celsius med blid omrøring. Derefter suspenderes pillen igen ved at pipettere op og ned.
Forbered en 10% saccharoseopløsning i PBS og filtrer den gennem et 0,2 mikrometer sprøjtefilter. Anbring 2,5 ml 10% saccharose i et ultracentrifugerør. Vip røret, og tilsæt langsomt de ni milliliter VLP-holdig prøve med en pipette med lav hastighed, mens du gradvist hæver røret til en lodret position.
Anbring rørene i rotorspandene, og centrifuger derefter prøverne ved 209.490 G i 90 minutter ved fire grader Celsius. Efter centrifugering fjernes supernatanten forsigtigt og placeres røret på hovedet på silkepapir for at fjerne eventuel resterende væske. Til didaktiske formål og bedre visualisering af den virale pellet kan nanoblade fyldt med fluorescerende protein mCherry fremstilles.
Efter et minut tilsættes 100 mikroliter PBS. Placer røret med et parafilmdæksel i en rørholder på et omrøringsbord i en time ved fire grader Celsius, og genophæns pelleten ved at pipettere op og ned. Fortyndingsbufferen forberedes ved at tilsætte et volumen lysisbuffer indeholdende et ikke-ionisk overfladeaktivt stof i fire volumener PBS.
Fortynd to mikroliter koncentrerede nanoblade i 50 mikroliter fortyndingsbuffer og hvirvel kortvarigt. Overfør 25 mikroliter af blandingen til et nyt rør indeholdende 25 mikroliter fortyndingsbuffer, og gentag proceduren for at få seks rør med nanobladfortyndinger. Lav standardkontrollen ved at tilføje to mikroliter rekombinant Cas9-nuklease i 50 mikroliter fortyndingsbuffer, hvirvel den kort og lav otte serielle fortyndinger.
Spot 2,5 mikroliter af hver VLP-fortynding og 2,5 mikroliter af hver standard på en nitrocellulosemembran forsigtigt med en flerkanalspipette. Når partiklerne er absorberet, blokeres membranen med TBST suppleret med 5% fedtfri tørmælk i 45 minutter ved stuetemperatur. Kassér TBST og inkuber membranen natten over ved fire grader Celsius med Cas9 peberrodsperoxidaseantistoffet.
Vask membranen tre gange med TBST og visualiser signalet ved hjælp af et forbedret kemiluminescerende substratsæt. Ved transduktion af målceller med nanoblade udskiftes cellekulturmediet med 500 mikroliter af mediet, der indeholder oprensede nanoblade. Efter fire til seks timers celleinkubation skal mediet udskiftes til den normale mængde frisk medium.
I protokollen blev celler podet til homogen fordeling med 70 til 80% sammenløb på transfektionsdagen, hvilket dannede syncytia, hvilket førte til større celler med flere kerner efter 24 timer. 40 timer efter transfektion dannede de fleste celler syncytia og begyndte at løsne sig fra pladen. Mængden af Cas9, der blev indlæst i nanoblade, blev kvantificeret ved hjælp af en prikket plet på en nitrocellulosemembran, som viste forbedret kemiluminescens sammenlignet med referencerebinanten Cas9.
En kalibreringskurve blev afbildet for det kvantificerede kemiluminescenssignal for rekombinante Cas9-fortyndinger mod den kendte mængde Cas9. Derefter blev Cas9-proteinkoncentrationen i hvert nanoblade-præparat kortlagt, hvilket afslørede forskellige koncentrationer af Cas9 fra batch til batch. T7-endonukleaseassayet viste, at nanoblades effektivitet kan variere fra batch til batch.
For eksempel blev en batch observeret at have 20% samlet redigeringseffektivitet, mens den anden batch viste 60% effektivitet. Flag-DDX3-proteiner blev immunudfældet ved hjælp af anti-flag agaroseperler, efterfulgt af Western blot-analyse af de genvundne proteiner ved hjælp af et anti-flag-antistof. Stedstyret indsættelse af flagmærket i DDX3-locus blev også analyseret af PCR ved hjælp af enten primere, der flankerer indsættelsesstedet, eller fremadgående og omvendte primere, der er specifikke for DDX3-locus nedstrøms for flagindsættelsesstedet.
Det er vigtigt at placere cellerne ved et korrekt sammenløb og opnå en jævn fordeling af cellerne. Ved nanobladcentrifugering er det også vigtigt at resuspend pellet og opnå en homogen prøve af koncentrerede virale partikler. Nanoblades har gjort det muligt for forskere at studere mekanismen for dobbeltstrenget DNA-brudreparation ved at levere Cas9 og guide RNA-komplekset til specifikke genomiske loci på en hurtig og koordineret måde.
De har også gjort det muligt at inaktivere lange ikke-kodende RNA'er i primære celler i det medfødte immunsystem for at studere deres rolle.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
