Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Single Myofiber Culture Assay för bedömning av vuxna muskelstamcellsfunktionalitet Ex Vivo
Chapters
Summary February 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
I detta protokoll beskrivs en in vitro-odlings- och funktionell analysmetod för muskelstamceller, vilket bevarar de flesta av deras interaktioner med deras endogena nisch.
Transcript
Muskelstamceller förblir associerade med sin endogena nisch och kan manipuleras enkelt, till exempel genom siRNA-transfektion. Denna metod gör det möjligt att analysera muskelstamceller i kultur i en miljö som liknar in vivo-situationen närmare än vanliga 2D-kulturmodeller genom att bevara nischen. Börja med att skära sterila pastörpipetter med en diamantpenna.
För varje mus, använd en stor borrpipeett med en öppning på ca 0,3 centimeter och en längd på ca 10 till 12 centimeter och en andra glaspipett med en liten öppning på ca 0,1 centimeter och en längd på cirka 22 centimeter. Jämna ut kanterna på båda pipetterna genom att hålla pipetterspetsarna i lågan på en Bunsenbrännare i fem till tio sekunder med mild rörelse. Omedelbart före användning, belägga båda pipetterna med sterilt hästserum genom att fylla hela pipetten med 2 ml hästserum i fem minuter, injicera sedan hästserumet och låta pipetten torka i fem minuter vid rumstemperatur.
Spraya all utrustning och musens bakben med 70% etanol. Använd härdad fin böjd sax och fina tångar för att ta bort huden och exponera de underliggande musklerna. Ta bort den omgivande fascian med de fina böjda tångarna utan att skada de underliggande musklerna.
För att ta bort tibialis främre eller TA, ta tag i den distala TA-senan med tång och skär den med fin sax. Medan du håller TA vid senan, dra den mot knäet och skär muskeln nära knäet för att exponera EDL-muskeln. Lyft den distala EDL-senan med böjda tångar och skär med fina Vannas vårsax.
Exponera den proximala EDL-senan genom att försiktigt dra EDL mot knäet. Skär sedan den proximala senan med sax. Inkubera EDL-musklerna i reaktionsröret vid 37 grader Celsius i ett cirkulerande vattenbad.
Stoppa matsmältningen när musklerna lossnar och en milfibrer är synliga. Att arbeta under ett sterilt kikarmikroskop utrustat med en värmeplatta spolade musklerna med varmt isoleringsmedium med hjälp av den stora borrpipetten. Dissociera musklerna med den stora borrpipetten tills önskat antal myofibrer flyter fritt i lösningen.
För att tvätta skräpet, använd den lilla borrglaspipetten för att överföra icke-kontrakterade myofibrer till den andra välfyllda med isoleringsmedium. Överför sedan 50 till 100 icke-kontrakterade myofibers till en brunn av en 24 brunnsplatta fylld med myofiberkulturmedium. Inkubera myofibrerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 72 till 96 timmar.
Transfect myofiber associerade muskel stamceller fyra timmar efter myofiber isolering. Kombinera 25 mikroliter Opti-MEM med respektive volym siRNA med 25 mikroliter Opti-MEM innehållande 1,5 mikroliter transfektreagens. Inkubera reaktionsblandningen i fem minuter och tillsätt den till cellerna i 24-brunnsplattan.
Inkubera sedan plattan vid 37 grader Celsius för tidsrespekt. Endast kritiska steg i immunofluorescent färgning protokollet visas här. Kassera försiktigt myofiberkulturmediet samtidigt som du lämnar någon lösning i brunnen.
Tillsätt 500 mikroliter av 2% paraformaldehyd för att fixa myofibrerna med sina intilliggande muskelstamceller. Inkubera plattan i fem minuter vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten och tvätta myofibrerna tre gånger med PBS.
Täck plattan med folie under inkubationsstegen efter inkubationen med sekundära antikroppar. Använd en hydrofobisk penna för att rita en cirkel på en mikroskopisk glasrutschbana. Överför sedan myofibrerna i minsta möjliga volym till bilden och sprid dem.
Ta bort restvätskan med den lilla borra pastörpipetten eller en 200 mikroliterpipett. Använd två droppar vattenhaltigt monteringsmedium och täck myofibrerna med en täcklapp. Låt sedan bilderna torka och lagra dem vid fyra grader celsius i mörkret följt av mikroskopisk analys.
Detta protokoll visar härledning och kultur av enskilda myofibers från murine EDL muskler. Immunofluorescent färgning för Pax7 användes för att identifiera atomkärnor i muskel stamceller. Det förstorade området exponerar myofibern med sin intilliggande muskelstamcell och demonstrerar PAX7 immunofluorescenssignalen i kärnan av en muskelstamcell.
Muskelstamceller myogen progression kan analyseras genom markör uttryck. Förekomst av Pax7 och avsaknad av MyoD uttryck är associerad med quiescent muskel stamceller av nyisolerade myofibrer. MyoD uttryck kan observeras i prolifererande muskel stamceller.
Efter 72 timmar bildar muskelstamceller kluster av avkomprogener med olika myogena tillstånd, som parallelleras med uttryck av olika myogena markörer. Pax7 endast celler är självförnyande stamceller. Pax7 och MyoD dubbelpositiva celler sprider sig.
Medan myo D är det bara celler som skiljer celler åt. SiRNA transfection av muskel stamceller visade ackumulering av cytoplasmic siRNA på ett granular sätt som indikerar effektiv upptag. Kvantifiering av transfected Pax7 positiva celler per myofiber visade att antalet transfected celler ökade upp till 74%efter 30 timmar utan negativ effekt på muskelstamcellstal.
När du försöker detta protokoll är det av yttersta vikt att noggrant dissekera EDL utan att orsaka någon skada. Förutom siRNA-transfektion är analys av transgena djur eller inkubation med rekombinanta proteiner möjlig för ytterligare funktionella analyser av muskelstamceller på deras intilliggande myofibrer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
