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げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ
Chapters
Summary June 3rd, 2021
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げっ歯類やヒト被験者の脳組織から 生き生きとした 生体試料中のアクチンフィラメントを定量化するための、シンプルで時間効率の高い高スループット蛍光分析ベースのアッセイを報告する。
Transcript
アクチンは細胞骨格の主要な構成要素であり、ニューロンを含む細胞形態および生理学のいくつかの側面を批判的に調節する。アクチンは、その2つの形態、単量体球状G-アクチンまたはポリマー糸状F-アクチンの間の平衡状態で生じる。アクチンの重合状態は、アクチン結合タンパク質と翻訳後の調節の両方によって、複数のレベルで厳しく調節されます。
ニューロン間シナプス接点では、F-アクチンレベルの動的変化が重要な調節イベントであり、シナプス前およびシナプス後の両方の端末でシグナル伝達と可塑性を制御します。当然のことながら、アクチン機能不全はいくつかの神経病理学的状態に関連している。最近の進歩は、神経生理学と病態生理学におけるアクチンの豊富な知識につながっています。
しかし、多くはまだ不明であり、焦点を当てる必要があります。この点で、ファロイジンの蛍光アナログはアクチン研究の主要なツールであることが証明されています。このファロトキシンは、具体的には糸状アクチンに結合し、したがって、F−アクチンの量、および病態生理学的状態におけるその変化の直接的な尺度として使用することができる。
本研究は、脳組織からの卸売ホモジネートや生化学的に単離されたシナプス末端など、元生体試料におけるアクチン重合状態の評価に関する迅速かつ効率的な蛍光測定アッセイを提示する。なお、アッセイは、他の細胞および組織タイプおよびそれらの関連する生理学的現象に適用することができる。本研究で使用されるバッファーのレシピについては、詳細なテキストを参照してください。
ラットまたはヒト被験者のいずれかからの脳組織サンプルは、10体積の均質化緩衝液中のポター・エルフェジェムガラス管および氷上の害虫で均質化された。シナプトソーム調製のために、ホモゲネートを、まず低速で紡糸し、次に高速で、粗シナプトソームミトコンドリア画分を得た。この粗分から濃縮シナプトソームは、不連続なスクロース勾配に続いて得られた。
シナプトニューロソーム製剤の場合、ホモジナイートは、2つの100ミクロンと1つの5ミクロンフィルタを順次通過した。タンパク質推定はブラッドフォード試薬を用いて行い、サンプルは50マイクロリットルの最終体積でmLタンパク質あたり2〜3ミリグラムの濃度でクレブスバッファーで希釈した。単離シナプス末端の刺激は、シナプトソームまたはシナプトニューロソームのいずれかであり、37度で細胞外カリウムの30秒の短い増加によって行われた。
このために、1つのモル塩化カリウムを、15ミリモルの最終濃度にサンプルに加えた。ホモジネートは、非刺激および脱分極性シナプス断片を2.5%グルタルアルデヒドで固定し、25%グルタルアルデヒドストック溶液の必要量を添加した。試料を室温で2分、3分間インキュベートした。
固定剤は、20,000Gで5分間遠心分離により除去した。その後、0.1%トリトンX-100および1mgのmLナトリウムを含むクレブスバッファーでの再懸濁による透過性を室温で2〜3分間進行させた。透過バッファーを遠心分離によって再び除去し、ペレットをクレブスバッファーで表面的に洗浄し、1X アレクサフルオール647 ファロイジンを含むクレブスバッファーで再懸濁し、500マイクロ単位のファロイジンに対応した。
結合を暗で室温で10分間進行させた。過剰な非結合ファロイジンを5分間20,000Gで遠心分離してサンプルから取り出し、ペレットをクレブスバッファーで表面的に洗浄し、シナプトソームまたはシナプトニューロソームの浮力を維持するために0.32モルスクロースを含むクレブスバッファーに再び再懸濁した。蛍光ファロイジン結合サンプルは、プレートリーダーでの透光測定用96ウェルブラックプレートに分配した。
励起波長と発光波長はそれぞれ645ナノメートルと670ナノメートルに設定された。実験の各セットのために、我々は0.32モルショ糖を含むクレブスバッファにAlexa Fluor 647ファロイジンの異なる量を含んでいた。洗浄工程中のサンプルの損失を考慮して、サンプルを黒色から透明な96ウェルプレートに移した。
その後、440ナノメートルでサンプルを採取した。蛍光ファロイジンの保持は、サンプル中のアクチンフィラメントまたはF-アクチンレベルの量に直接比例する。ファロイジン結合の直線性は、50〜200マイクログラムタンパク質の範囲で観察された。
原理の証明として、我々はまた、ラトランクリンAによるアクチンフィラメントの薬理学的破壊を用いたF-アクチン脱重化モデルにおけるアッセイの有効性、ならびに単離シナプス末端のKCl媒介刺激によるF-アクチン形成の刺激を試験した。結合ファロイジンからの蛍光発光は、標準的な線形曲線から生成された結合ファロイジンの単位として表すことができる、および対照試料に対して相対的である。図4の場合、F-アクチンレベルは、結合ファロイジンのマイクロ単位として表される。
一方、図5のF-アクチンレベルについては、脱分極化シナプス断片は、対照非分極サンプルに対して相対的に発現される。我々は、アクチンフィラメント、またはF-アクチンの分析のための堅牢で時間効率の高い高スループットアッセイ、および96ウェルプレート形式に適した生理学的および病態生理学的状態におけるその変化について述べた。アッセイは、既存の代替プロトコルよりもはるかに高速であり、単独で、または既存の免疫学的化学およびウェスタンブロッティングベースのアッセイと組み合わせて、アクチン関連の研究に不可欠なツールとして役立つことができます。
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