Biology
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एक उपन्यास रोबोटिक सिस्टम, स्पॉटिटन का उपयोग करके समय-हल किए गए अध्ययनों के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक ग्रिड तैयारी
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Summary February 25th, 2021
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यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्पॉटिटन, एक उपन्यास रोबोटिक प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है, जो एक आत्म-बाती, नैनोवायर ग्रिड पर ब्याज के दो नमूने वितरित करता है जो तरल क्रायोजेन में विट्रीफिकेशन से पहले न्यूनतम 90 एमएस के लिए मिश्रण करता है।
Transcript
स्पॉटिटन रोबोटिक सिस्टम का उपयोग करके, कोई भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ग्रिड पर एक बातचीत करने वाले साथी के साथ ब्याज के प्रोटीन को 90 मिलीसेकंड के रूप में तेजी से मिला सकता है और विटिफाई कर सकता है। यह प्रोटोकॉल मध्यवर्ती प्रोटीन पुष्टिकरण को पकड़ने की अनुमति देता है जो मानक ग्रिड तैयारी तकनीकों द्वारा कब्जा करने के लिए बहुत क्षणिक हैं। समय हल स्पॉटिटन झिल्ली चैनल सक्रियण, डीएनए या आरएनए संश्लेषण, या अपने लक्षित प्रोटीन के साथ दवा या एंटीबॉडी की शुरुआती बातचीत जैसे उप-दूसरे जैविक या जैव रासायनिक प्रणालियों को सूचित कर सकता है।
उपयोगकर्ता को समवर्ती रूप से कई घटकों का प्रबंधन करना चाहिए जो सीधे ग्रिड की गुणवत्ता को प्रभावित करते हैं। ग्रिड तैयार करते समय उपयोग करने से पहले सिस्टम को समझना और धैर्य रखना महत्वपूर्ण है। शुरू करने के लिए, नाइट्रोजन आपूर्ति टैंक पर मुख्य वाल्व खोलें और यह सुनिश्चित करें कि सिस्टम जलाशय डी-गैस्ड अल्ट्रापुरे पानी से भरा हुआ है।
मल्टी आउटलेट पावर स्ट्रिप पर कंप्यूटर और स्पॉटिटन सिस्टम चालू करें। स्पॉटिटन सॉफ्टवेयर का यूजर इंटरफेस खोलने के लिए डेस्कटॉप आइकन पर क्लिक करें। टूल्स मेनू में, तीन धुरी रोबोटों और घूर्णन डिस्पेंसर हेड असेंबली को शुरू करने और घर करने के लिए प्रारंभिक चरणों का चयन करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि डिस्पेंसर टिप्स आरंभीकरण और होमिंग से पहले इशारा कर रहे हैं।
मुख्य मेनू पर, रोबोट को सुरक्षित स्थिति में भेजने के लिए सुरक्षित स्थिति में जाने पर क्लिक करें। एस्पिरेट टैब पर, जलाशय से पानी के साथ कई बार डिस्पेंसर सिर फ्लश करने के लिए प्राइम का चयन करें। जब तक पानी की दो निर्बाध धाराओं सुझावों से उभरते देखा जा सकता है जारी रखें ।
निरीक्षण टैब पर, निरीक्षण कैमरे में टिप एक भेजें और अग्नि जल का परीक्षण करें, जब तक कि असतत बूंदों का उत्पादन न हो जाए तब तक आयाम को समायोजित करें। टिप एक फायरिंग का एक वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए ऊपरी कैमरा मॉनिटर में रिकॉर्ड बटन दबाएं। निरीक्षण कैमरे के लिए टिप दो भेजें।
टिप के वीडियो को वापस खेलें दाईं ओर मॉनिटर में एक ही समय टिप दो ऊपरी कैमरा मॉनिटर में निकाल दिया जाता है, जो दो डिस्पेंसर से बूंद उत्पादन के पैटर्न से मेल खाते हैं। आपूर्ति एलन कुंजी का उपयोग कर ग्रिड रोबोट पर माउंट से चिमटी निकालें। पास के बेंचटॉप पर, ग्रिड ब्लॉक के किनारे पर एक परीक्षण ग्रिड नैनोवायर साइड की स्थिति है।
ध्यान से ग्रिड के रिम को पकड़ो और चिमटी में इसे सही ढंग से स्थिति। इसके बाद चिमटी को रिमाउंट करें। क्रायो टैब पर, ऊपरी डुबकी पथ कैमरे के दृश्य के क्षेत्र में टिप एक को स्थानांतरित करने के लिए टिप टू कैमरा पर क्लिक करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि लाइव को ऊपरी कैमरा मॉनिटर में चुना गया है।
ऊपरी कैमरे की रोशनी चालू करें और समायोजित करें। मॉनिटर के भीतर माउस पर क्लिक करके, ऊपरी कैमरे की निगरानी में दिखाई देने वाली स्थिति टिप एक। ऊपरी कैमरे के सामने ग्रिड की स्थिति के लिए ग्रिड टू कैमरा पर क्लिक करें, फिर जरूरत पड़ने पर एक स्थिति को फिर से समायोजित करें।
क्रायो टैब पर, यह सुनिश्चित करें कि विट्रिफाइड ग्रिड का चयन नहीं किया गया है, क्यू लक्ष्य पर क्लिक करें, फिर डुबकी पर। डिस्पेंसर सामान्य रूप से काम कर रहे हैं की पुष्टि करने के लिए ऊपरी और निचले छवियों का मूल्यांकन करें। एक उपयुक्त बफर के साथ वांछित सांद्रता के लिए दो नमूनों को पतला करें, आदर्श रूप से दोनों के लिए समान उपयोग करें, और तरल नाइट्रोजन के साथ क्रायोजेन बाउल भरें।
प्लाज्मा पांच वाट हाइड्रोजन और ऑक्सीजन का उपयोग कर तीन से चार नैनोवायर ग्रिड साफ, और प्रारंभिक बिंदु के रूप में १.५ मिनट । नेबुलाइजर में प्लग करें और वाष्प को नेबुलाइजर कैप के केंद्रीय बंदरगाह से बाहर निकलें। मुख्य खिड़की में लाइव आर्द्रता मॉनिटर का निरीक्षण करें या रिपोर्ट और परिवेश के तहत परिवेश आर्द्रता ट्रैकर खोलें।
कक्ष और कफन क्षेत्रों में आर्द्रता के स्तर की जांच करें। नमूना कप में प्रत्येक नमूने के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। बाईं ओर टिप एक के लिए एक नमूना के साथ होल्डिंग ट्रे में नमूना कप लोड और दाईं ओर दो टिप के लिए ।
फिर ट्रे को मशीन में वापस पुश करें जब तक कि यह सीट न हो जाए। एस्पिरेट टैब पर, प्रत्येक टिप द्वारा एस्पिरेटेड होने वाले वॉल्यूम के लिए तीन माइक्रोलीटर का चयन करें। सुनिश्चित करें कि नमूना ट्रे को सुरक्षित रूप से बैठाया गया है, एस्पिरेट पर क्लिक करें, और पिपेट चरण का निरीक्षण करें जो डिस्पेंसर के सिर को नमूना कप में ले जाएं।
नमूना कप को हटाकर और तरल स्तर में एक बूंद देख कर दोनों नमूनों की सफल आकांक्षा को सत्यापित करें। निरीक्षण टैब पर, अबाधित वितरण की पुष्टि करने के लिए निरीक्षण कैमरे के लिए प्रत्येक टिप भेजें। प्रत्येक टिप से बूंद गठन से मेल खाने के लिए आवश्यकतानुसार आयाम को समायोजित करें।
चिमटी में एक हौसले से प्लाज्मा साफ ग्रिड लोड, लेकिन चिमटी अभी तक माउंट नहीं है । सुनिश्चित करें कि आर्द्रता का स्तर लगभग 90 से 95% तक ऊंचा है एथेन कप भरें और निरीक्षण कैमरे के सामने दोनों सुझावों की अंतिम परीक्षण आग करें, जिससे कोई बाधा नहीं है। क्रायो टैब पर, टिप टू कैमरा पर क्लिक करें।
एथेन कप की जांच करें। यदि एथेन बर्फ का गठन किया है, अतिरिक्त इथेन गैस के साथ की जरूरत के रूप में पिघल । ग्रिड चरण पर ग्रिड के साथ चिमटी माउंट।
क्रायो टैब पर, ग्रिड टू कैमरा पर क्लिक करें, टिप सुनिश्चित करना ऊपरी कैमरा मॉनिटर में सही ढंग से तैनात है। Vitrified ग्रिड, कतार लक्ष्य पर क्लिक करें, तो डुबकी । ठीक पर क्लिक करें जब ग्रिड रोबोट को एथेन से ग्रिड को तरल नाइट्रोजन में हॉप करने और जलमग्न शेल्फ पर छोड़ने के लिए प्रेरित किया।
यह तय करने के लिए ग्रिड की छवियों की जांच करें कि इसे रखा जाना चाहिए या त्याग दिया जाना चाहिए। ग्रिड रखते हुए, पूर्व शांत ठीक इत्तला दे दी संदंश, धीरे किनारे से ग्रिड समझ, और यह एक ग्रिड बॉक्स स्लॉट में जगह है, पायदान के बाईं ओर पहले स्लॉट के साथ शुरू करने और दक्षिणावर्त जा रहा है । रिपोर्ट और प्रयोग का चयन करके डुबकी के समय मशीन सेटिंग्स और आर्द्रता माप के साथ ऊपरी और निचले कैमरों से ग्रिड छवियों की समीक्षा और तुलना करने के लिए प्रयोग दर्शक का उपयोग करें।
एक १०५ बेस जोड़ी डीएनए ओलिगोमर में आरएनए पॉलीमरेज को मिलाकर एक ही बार-हल किए गए स्पॉटिटन सत्र के दौरान तैयार ग्रिडों की छवियां विट्रीफिकेशन से पहले १५० मिलीसेकंड के लिए प्रमोटर अनुक्रम ले जाती हैं । छह ग्रिडों में से, केवल एक उप-ोप्टिमल बाती दिखाता है। विट्रीफाइड ग्रिड पर बर्फ जमाव का पैटर्न ऊपरी कैमरे की छवि में देखे गए जमा तरल के पैटर्न के साथ निकटता से मेल खाता है।
मिश्रित नमूनों की प्रभावी बाती नैनोवायर कवर ग्रिड सलाखों के साथ होती है जहां नमूना शायद ही कभी उन वर्गों में बहता है जिनमें यह उतरा था। बर्फ से भरे वर्गों में, बर्फ आम तौर पर वर्ग के केंद्र में छेद के भीतर सबसे मोटी है और ग्रिड सलाखों के करीब छेद में पतली हो जाता है । नैनोवायर्स की निकटता के कारण ग्रिड बार के तुरंत निकट छेद अक्सर खाली होते हैं।
नैनोवायर ग्रिड की उचित तैयारी और हैंडलिंग मिश्रित नमूना ग्रिड पर अच्छी बर्फ की मोटाई सुनिश्चित करेगी। स्पॉटिटन सिस्टम उपयोगकर्ता को एक ही ग्रिड पर अलग से दो नमूनों को जमा करने की अनुमति देता है, जिससे एक ही ग्रिड रखरखाव सत्र के दौरान एक अनमिक्स्ड नियंत्रण का संग्रह सक्षम होता है। स्पॉटिटन ने वास्तविक समय में बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति में पहले मध्यवर्ती का कब्जा करने में सक्षम बनाया है।
क्योंकि वे एक उप-दूसरे टाइमस्केल पर बनाते हैं, उनकी संरचनाएं अब तक अज्ञात हैं।
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