Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Konfokal laserscanning Mikroskopi af calciumdynamik i akutte musespytkirtelvævsskiver
Chapters
Summary April 13th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer fremstillingen af akutte bugspytkirtelvævsskiver og deres anvendelse i konfokal laserscanningsmikroskopi til at studere calciumdynamik samtidigt i et stort antal levende celler over lange tidsperioder og med høj spatiotemporal opløsning.
Transcript
I kombination med levende celle calciumbilleddannelse muliggør den akutte bugspytkirtelvævsskiveteknik undersøgelsen af intercellulære bølger og flercellet funktionel forbindelse med høj opløsning over lange tidsperioder. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at den er hurtig, bevarer vævsarkitektur og reducerer begrænset enzymatisk og mekanisk belastning, samtidig med at der opretholdes et højt udbytte af væv. Ved at detektere funktionelle og morfologiske ændringer under sygdomsprogression hjælper denne teknik vores forståelse af de bugspytkirtelrelaterede sygdomme, såsom diabetes.
Denne vævsskiveteknik kan anvendes på hjerne-, hypofyse- og binyrevæv med vægt på bevarelse af intercellulær kontakt, parakrine interaktioner og vævsarkitektur. For at forberede injektion af agarose i musens bugspytkirtel skal du fylde en fem milliliter sprøjte med 40 grader Celsius flydende agarose og udstyre sprøjten med en 30 gauge nål. Efter forsigtigt at have dækket nålen med en hætte, skal du placere sprøjtenålens ende ned med hele volumenet af agarose under vandoverfladen i et 40 grader Celsius vandbad.
Boble en flaske ekstracellulær opløsning med carbogen, kontinuerligt på is, ved 1,5 milliliter i minuttet ved barometertryk og stuetemperatur for at sikre iltning og en pH på 7,4. For at udføre agaroseinjektionen skal du placere en aflivet voksen mus under et stereomikroskop og få adgang til musens mave via laparotomi. Flyt forsigtigt tarmen til venstre side for at udsætte den fælles galdekanal og brug pincet til let at løfte den duodenale ende af kanalen for at lokalisere Vaters papilla.
Brug en hæmostat til at klemme galdekanalen ved duodenalpapillen for at forhindre lækage af agarosen fra kanalen ind i tolvfingertarmen og brug en lille skarp tang til at nå under den fælles galdekanal for at bryde membranen, der fastgør kanalen til bugspytkirtelvævet. Efter at have ryddet så meget fedt og bindevæv fra kanalen som muligt, skal du placere kanalen vinkelret på spidserne af et par større tang og trykke fast på sprøjtestemplet, injicere den viskøse flydende agarose i den proksimale ende af den fælles galdekanal i 20 til 30 sekunder. Når vævet bliver hvidligt og let udspilet, fjern sprøjten og hæld langsomt 20 ml af den boblede iskolde ekstracellulære opløsning på bugspytkirtlen for at afkøle vævet og hærde agarosen.
For at erhverve skiver i bugspytkirtlen skal du bruge tang og fine hårde snit saks til forsigtigt at overføre den agaroseindsprøjtede bugspytkirtel til en 100 millimeter petriskål indeholdende 40 ml iskold ekstracellulær opløsning. Hvirvl skålen for at skylle vævet og overfør bugspytkirtlen til en anden skål med iskold ekstracellulær opløsning. Brug tangen og saksen til at skære den hvidlige, godt injicerede bugspytkirtelsektion i op til seks stykker på 0,1 til 0,2 kubikcentimeter og fjern eventuelt resterende bindevæv og fedtvæv fra vævsstykkerne.
Læg de rensede blokke i en 35 millimeter ikke-klæbrig bund petriskål indeholdende cirka fem milliliter 40 grader Celsius flydende agarose, og læg straks petriskålen på is. Når agarosen er hærdet, skal du holde petriskålen på hovedet over låget på et 100 millimeter petriskål og bruge halvdelen af et barberblad til forsigtigt at skære i kanten mellem petriskålens sidevæg og agarosen for at fjerne agarosen fra fadet. Brug barberbladet til at skære individuelle terninger, der hver indeholder en vævsblok af agarose, fra den frigjorte agarose og brug cyanoacrylatlim til at fastgøre blokkene til prøvepladen på en vibratom.
Fyld vibratomets skærekammer med 150 ml iskold ekstracellulær opløsning, der kontinuerligt bobles med carbogen. Skru fastgør prøvepladen på vibratomen, og monter et nyt barberblad. Omgiv kammeret med is og tilsæt to 10 ml volumen isterninger lavet med ekstracellulær opløsning suppleret med seks millimolar glucose.
Indstil skiveværktøjet til 0,05 til 1 millimeter i sekundet og 70 hertz, og begynd derefter at skære for at erhverve 140 mikron tykke agaroseskiver med et overfladeareal på 20 til 100 kvadratmillimeter. Brug en fin pensel til forsigtigt at overføre hver skive til en 100 millimeter petriskål fyldt med 40 millimeter HEPES-buffer suppleret med seks millimolar glukose. Til calciumfarvestofpræparat opløses 50 mikrogram cellegennemtrængeligt calciumindikatorfarvestof, 7,5 mikroliter DMSO og 2,5 mikroliter poloxamer og 6,667 ml HBS i et 15 ml skruelågrør.
Brug en pipette til grundigt at blande opløsningen i 20 sekunder, før du nedsænker røret i et ultralydsbadkammer og hvirvler, hver i 30 sekunder. Derefter aliquot 3.333 ml af den resulterende calciumindikatorfarvestofopløsning i en 5 ml petriskål pr. 10 skiver væv, der skal mærkes. Til farvestofbelastning skal du bruge en tynd blød pensel til at overføre op til 10 vævsskiver til hver skål med farvestofopløsning og placere opvasken på en orbitalryster i 50 minutter ved stuetemperatur og 40 omdrejninger i minuttet beskyttet mod lys.
Ved afslutningen af inkubationen overføres op til 20 farvede skiver til individuelle 60 ml petriskåle fyldt med farvestoffri HBS. Til calciumbilleddannelse ved konfokal mikroskopi vælges en 20 eller 25 gange forstørrelse og indstilles opsamlingstilstanden til timelapsebilleddannelse, pinhole til 100 til 200 mikron og excitering og emission for fluoroforen, der anvendes i eksperimentet. Optagekammeret og perfusionssystemet anbringes på mikroskopets temperaturstyrede trin, og indløbet og udløbet anbringes på optagekammerets yderste kanter.
Indstil indstrømnings- og udstrømningshastighederne til en til to milliliter pr. Minut. Indstil temperaturen på overflodssystemet til 37 grader Celsius og initier overfloden med den ikke-stimulerende opløsning. For at registrere vævets calciumdynamik placeres en enkelt vævsskive i optagekammeret og immobilisere vævet med en U-formet platinvægt med et stramt nylonnet.
Brug indstillingen bright-field til at lokalisere strukturen af interesse og brug live imaging til at placere de studerede strukturer i synsfeltet. For at optimere signal-støj-forholdet skal du justere lasereffekten, detektorforstærkningen og linjegennemsnittet, mens lasereffekten holdes minimal. Juster fokusplanet til 15 mikron under skærefladen for at undgå optagelse fra potentielt beskadigede celler og få billederne.
Indstilling af samplingsfrekvensen til en til to hertz for at muliggøre den indledende detektion af individuelle svingninger og optagelse af et billede i høj opløsning. Hvis det er tilgængeligt, skal du bruge et online diagram til at få øjeblikkelig feedback om forberedelsesresponsen, overbelysning, fotobleaching og mekanisk drift. Når alle billederne er erhvervet, skal du gemme dataene til senere analyse.
Her kan der observeres et eksempel på en optimal vævsskive, hvor det cellegennemtrængelige calciumindikatorfarvestof med succes blev indlæst i bugspytkirtelvævsskiven. I modsætning hertil er disse vævsskiver ikke optimale til billeddannelse på grund af enten en mislykket farvestofindtrængning, mangel på øceller eller en overflod af nekrotisk væv på prøveoverfladen. Billeder i høj opløsning af en bugspytkirtelvævsskive kan bruges til at afgrænse forskellige områder af bugspytkirtelvævet, såsom øerne Langerhans, acinarvæv eller bugspytkirtelkanalen.
Stimuli kan bruges til funktionelt at skelne mellem forskellige øceller eller mellem ø- og ikke-øceller. For eksempel reagerer betaceller typisk på en kvadratisk pulsglukosestimulering ved at udvise en forbigående stigning i intracellulært calcium efterfulgt af en hurtig calciumoscillation på et vedvarende plateau. I modsætning hertil reagerer ikke-beta-celler med hurtigere og mere uregelmæssige svingninger.
En forsinkelse i begyndelsen af intracellulær calciumforøgelse efter stimulering samt heterogenitet og forsinkelser blandt individuelle celler kan også måles. De samme parametre kan bruges til at beskrive deaktiveringsfasen. Her kan en skematisk præsentation af den intracellulære calciumoscillationsvarighed, frekvens og procentdel af aktiv tid observeres.
Ved billeddannelse ved erhvervelseshastigheder større end 10 hertz kan calciumbølger, der gentagne gange spredes over øen, tydeligt genkendes. Klem den fælles galdekanal så tæt på tolvfingertarmen som muligt for at forhindre utilsigtet okklusion af grenen, der kommer ind i bugspytkirtlen. Stop heller ikke med at trykke stemplet under injektionen, fordi agarosen straks hærder i nålen.
Den akutte muse-bugspytkirtelvævsskiveteknik kan også anvendes med patch clamp-metoden til at studere ionkanalstrømme og adgangscytose samt immunohistokemiske undersøgelser og sekretærstudier.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
