Biology
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तीव्र माउस अग्नाशयी ऊतक स्लाइस में कैल्शियम गतिशीलता के कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी
Chapters
Summary April 13th, 2021
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हम तीव्र अग्नाशयी ऊतक स्लाइस की तैयारी और कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी में उनके उपयोग को बड़ी संख्या में जीवित कोशिकाओं में एक साथ कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए प्रस्तुत करते हैं, लंबे समय तक, और उच्च स्थानिक संकल्प के साथ।
Transcript
लाइव सेल कैल्शियम इमेजिंग के साथ संयोजन में, तीव्र अग्न्याशय ऊतक टुकड़ा तकनीक लंबे समय तक उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ अंतरकोशिकीय तरंगों और बहुकोशिकीय कार्यात्मक कनेक्टिविटी के अध्ययन को सक्षम बनाती है। इस तकनीक के मुख्य फायदे यह हैं कि यह तेज है, ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करता है, और ऊतक की उच्च उपज को बनाए रखते हुए सीमित एंजाइमी और यांत्रिक तनाव को कम करता है। रोग की प्रगति के दौरान कार्यात्मक और रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगाकर, यह तकनीक मधुमेह जैसे अग्न्याशय से संबंधित बीमारियों की हमारी समझ में मदद करती है।
इस ऊतक टुकड़ा तकनीक को मस्तिष्क, पिट्यूटरी और अधिवृक्क ऊतकों पर अंतरकोशिकीय संपर्क, पैराक्राइन इंटरैक्शन और ऊतक वास्तुकला के संरक्षण पर जोर देने के साथ लागू किया जा सकता है। माउस अग्न्याशय में एगरोज के इंजेक्शन के लिए तैयार करने के लिए, 40 डिग्री सेल्सियस तरल एगरोज़ के साथ एक पांच मिलीलीटर सिरिंज भरें और सिरिंज को 30 गेज सुई से लैस करें। सुई को सावधानीपूर्वक एक टोपी के साथ कवर करने के बाद, सिरिंज सुई अंत को नीचे रखें, पानी की सतह के नीचे एगरोज़ की पूरी मात्रा के साथ, 40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में।
कार्बोजेन के साथ बाह्य समाधान की एक बोतल को बुलबुला करें, बर्फ पर लगातार, बैरोमीटर दबाव और कमरे के तापमान पर 1.5 मिलीलीटर प्रति मिनट पर ऑक्सीजन और 7.4 का पीएच सुनिश्चित करने के लिए। एगरोज़ इंजेक्शन करने के लिए स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत एक इच्छामृत्यु वयस्क माउस रखें और लैपरोटॉमी के माध्यम से माउस पेट तक पहुंचें। धीरे आंत को बाईं ओर ले जाने के लिए आम पित्त नली को बेनकाब करने के लिए और वेटर के पैपिला का पता लगाने के लिए वाहिनी के ग्रहणी छोर को थोड़ा उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
ग्रहणी में वाहिनी से अगारोज के रिसाव को रोकने के लिए ग्रहणी पैपिला पर पित्त वाहिनी को दबाने के लिए एक हेमोस्टैट का उपयोग करें और झिल्ली को तोड़ने के लिए सामान्य पित्त नली के नीचे पहुंचने के लिए एक छोटे तेज संदंश का उपयोग करें जो अग्नाशयी ऊतक को नलिका से जोड़ता है। जितना संभव हो उतना वसा और संयोजी ऊतक को साफ़ करने के बाद, वाहिनी को बड़े संदंश की एक जोड़ी की युक्तियों पर लंबवत रखें, और सिरिंज सवार पर दृढ़ता से दबाएं, चिपचिपा तरल एगरोज को 20 से 30 सेकंड के लिए आम पित्त नली के समीपस्थ छोर में इंजेक्ट करें। जब ऊतक सफेद हो जाता है और थोड़ा विघटित हो जाता है तो सिरिंज को हटा दें और धीरे-धीरे ऊतक को ठंडा करने और अगारोज को कठोर करने के लिए अग्न्याशय पर बुलबुले वाले बर्फ-ठंडे बाह्य समाधान के 20 मिलीलीटर डालें।
अग्नाशयी ऊतक स्लाइस प्राप्त करने के लिए संदंश और ठीक कठिन कट कैंची का उपयोग धीरे से एक 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में एक 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए बर्फ ठंडा बाह्य समाधान के 40 मिलीलीटर युक्त. ऊतक को कुल्ला करने और अग्न्याशय को बर्फ-ठंडे बाह्य समाधान के दूसरे पकवान में स्थानांतरित करने के लिए पकवान को घुमाएं। संदंश और कैंची का प्रयोग करें सफेद, अच्छी तरह से इंजेक्शन अग्न्याशय अनुभाग को छह 0.1 से 0.2 घन सेंटीमीटर टुकड़ों में काटने और ऊतक के टुकड़ों से किसी भी शेष संयोजी और फैटी ऊतक को हटाने के लिए।
साफ किए गए ब्लॉकों को 35 मिलीमीटर गैर-चिपचिपा नीचे पेट्री डिश में रखें जिसमें 40 डिग्री सेल्सियस तरल एगरोज़ के लगभग पांच मिलीलीटर हों और तुरंत पेट्री डिश को बर्फ पर रखें। जब एगरोज़ कठोर हो जाता है, तो पेट्री डिश को 100 मिलीमीटर पेट्री डिश के ढक्कन पर उल्टा रखें और डिश से एगरोज़ को हटाने के लिए पेट्री डिश और एगरोज़ की पार्श्व दीवार के बीच मार्जिन में सावधानीपूर्वक कटौती करने के लिए रेजर ब्लेड के आधे हिस्से का उपयोग करें। अलग-अलग क्यूब्स को काटने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें, प्रत्येक में एग्रोज के एक ऊतक ब्लॉक होते हैं, मुक्त एगरोज़ से और ब्लॉक को वाइब्रेटोम की नमूना प्लेट में संलग्न करने के लिए साइनोएक्रिलेट गोंद का उपयोग करें।
150 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे बाह्य समाधान के साथ वाइब्रेटोम के काटने के कक्ष को लगातार कार्बोजन के साथ बुलबुला भरें। पेंच कंपन पर नमूना प्लेट को ठीक करें और एक नया रेजर ब्लेड माउंट करें। बर्फ के साथ कक्ष को घेरें और छह मिलीमोलर ग्लूकोज के साथ पूरक बाह्य समाधान के साथ बने दो 10 मिलीलीटर वॉल्यूम बर्फ के टुकड़े जोड़ें।
स्लाइसर को 0.05 से 1 मिलीमीटर प्रति सेकंड और 70 हर्ट्ज पर सेट करें, फिर 20 से 100 वर्ग मिलीमीटर सतह क्षेत्र के साथ 140 माइक्रोन मोटी एगरोज स्लाइस प्राप्त करने के लिए टुकड़ा करना शुरू करें। प्रत्येक टुकड़े को छह मिलीमीटर ग्लूकोज के साथ पूरक एचईपीईएस बफर के 40 मिलीमीटर से भरे 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करने के लिए एक ठीक पेंट ब्रश का उपयोग करें। कैल्शियम डाई की तैयारी के लिए, 50 माइक्रोग्राम सेल पारगम्य कैल्शियम सूचक डाई, डीएमएसओ के 7.5 माइक्रोलीटर, और पोलोक्सामर के 2.5 माइक्रोलीटर, और 15 मिलीलीटर स्क्रू कैप ट्यूब में एचबीएस के 6.667 मिलीलीटर भंग करें।
एक अल्ट्रासोनिक स्नान कक्ष और भंवर में ट्यूब डूबने से पहले 20 सेकंड के लिए समाधान को अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें, प्रत्येक 30 सेकंड के लिए। फिर परिणामी कैल्शियम सूचक डाई समाधान के 3.333 मिलीलीटर को एक 5 मिलीलीटर पेट्री डिश में लेबल करने के लिए ऊतक के 10 स्लाइस प्रति में विभाज्य करें। डाई लोडिंग के लिए, डाई समाधान के प्रत्येक डिश में 10 ऊतक स्लाइस तक स्थानांतरित करने के लिए एक पतली नरम पेंटब्रश का उपयोग करें और कमरे के तापमान पर 50 मिनट के लिए कक्षीय शेकर पर व्यंजन रखें और प्रकाश से संरक्षित प्रति मिनट 40 क्रांतियां रखें।
इनक्यूबेशन के अंत में, डाई-मुक्त एचबीएस से भरे व्यक्तिगत 60 मिलीलीटर पेट्री व्यंजनों में 20 दाग वाले स्लाइस तक स्थानांतरित करें। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कैल्शियम इमेजिंग के लिए 20 या 25 गुना आवर्धन का चयन करें और अधिग्रहण मोड को टाइम-लैप्स इमेजिंग, पिनहोल को 100 से 200 माइक्रोन, और प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोर के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन पर सेट करें। माइक्रोस्कोप के तापमान नियंत्रित चरण पर रिकॉर्डिंग कक्ष और छिड़काव प्रणाली माउंट और रिकॉर्डिंग कक्ष के दूर किनारों पर इनलेट और आउटलेट की स्थिति।
प्रवाह और बहिर्वाह दरों को एक से दो मिलीलीटर प्रति मिनट पर सेट करें। प्रोफ्यूजन सिस्टम के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और गैर-उत्तेजक समाधान के साथ प्रोफ्यूजन शुरू करें। ऊतक की कैल्शियम गतिशीलता को रिकॉर्ड करने के लिए रिकॉर्डिंग कक्ष में एक एकल ऊतक टुकड़ा रखें और एक तना हुआ नायलॉन जाल के साथ यू-आकार के प्लैटिनम वजन के साथ ऊतक को स्थिर करें।
ब्याज की संरचना का पता लगाने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र विकल्प का उपयोग करें और अध्ययन की गई संरचनाओं को देखने के क्षेत्र में रखने के लिए लाइव इमेजिंग का उपयोग करें। सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अनुकूलित करने के लिए, लेजर पावर को न्यूनतम रखते हुए लेजर पावर, डिटेक्टर प्रवर्धन और लाइन औसत बिनिंग को समायोजित करें। संभावित क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग से बचने और छवियों को प्राप्त करने के लिए कट सतह के नीचे 15 माइक्रोन के लिए फोकल विमान को समायोजित करें।
व्यक्तिगत दोलनों की प्रारंभिक पहचान और एक उच्च रिज़ॉल्यूशन छवि रिकॉर्ड करने की अनुमति देने के लिए नमूना आवृत्ति को एक से दो हर्ट्ज पर सेट करना। यदि उपलब्ध हो, तो रोशनी, फोटोब्लीचिंग और यांत्रिक बहाव पर तैयारी प्रतिक्रिया पर त्वरित प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए एक ऑनलाइन चार्ट का उपयोग करें। जब सभी छवियों का अधिग्रहण किया गया है, तो बाद के विश्लेषण के लिए डेटा सहेजें।
यहां एक इष्टतम ऊतक स्लाइस का एक उदाहरण देखा जा सकता है जिसमें सेल पारगम्य कैल्शियम सूचक डाई को अग्नाशयी ऊतक टुकड़े में सफलतापूर्वक लोड किया गया था। इसके विपरीत, ये ऊतक स्लाइस या तो एक असफल डाई प्रवेश, आइलेट कोशिकाओं की कमी, या नमूने की सतह पर नेक्रोटिक ऊतक की बहुतायत के कारण इमेजिंग के लिए इष्टतम नहीं हैं। अग्नाशयी ऊतक टुकड़े की उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों का उपयोग अग्नाशयी ऊतक के अलग-अलग क्षेत्रों को चित्रित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि लैंगरहैंस, एसिनार ऊतक या अग्नाशयी वाहिनी के आइलेट्स।
उत्तेजनाओं का उपयोग विभिन्न आइलेट कोशिकाओं के बीच या आइलेट और गैर-आइलेट कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक रूप से भेदभाव करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बीटा कोशिकाएं आमतौर पर इंट्रासेल्युलर कैल्शियम में क्षणिक वृद्धि का प्रदर्शन करके एक वर्ग पल्स ग्लूकोज उत्तेजना का जवाब देती हैं, जिसके बाद एक निरंतर पठार पर तेजी से कैल्शियम दोलन होता है। इसके विपरीत, गैर-बीटा कोशिकाएं तेजी से और अधिक अनियमित दोलनों के साथ प्रतिक्रिया करती हैं।
उत्तेजना के बाद इंट्रासेल्युलर कैल्शियम वृद्धि की शुरुआत में देरी, साथ ही व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच विषमता और देरी को भी मापा जा सकता है। निष्क्रियकरण चरण का वर्णन करने के लिए समान मापदंडों का उपयोग किया जा सकता है। यहां इंट्रासेल्युलर कैल्शियम दोलन अवधि, आवृत्ति और सक्रिय समय के प्रतिशत की एक योजनाबद्ध प्रस्तुति देखी जा सकती है।
10 हर्ट्ज से अधिक अधिग्रहण दरों पर इमेजिंग करते समय, कैल्शियम तरंगें जो बार-बार आइलेट में फैलती हैं, उन्हें स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है। अग्न्याशय में प्रवेश करने वाली शाखा को गलती से रोकने के लिए सामान्य पित्त नली को ग्रहणी के जितना संभव हो उतना बारीकी से दबाएं। इसके अलावा, इंजेक्शन के दौरान सवार को निराश करना बंद न करें क्योंकि एगरोज सुई में तुरंत कठोर हो जाएगा।
तीव्र माउस अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा तकनीक का उपयोग पैच क्लैंप विधि के साथ आयन चैनल धाराओं का अध्ययन करने और साइटोसिस के साथ-साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन और सचिव अध्ययन तक पहुंचने के लिए भी किया जा सकता है।
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