Login processing...

JoVE Journal
Biology

This content is Open Access.

JoVE Journal Biology

Confocal Laser Skanning Mikroskopi Av Kalsiumdynamikk i Akutt Mus Bukspyttkjertelen Vev Skiver

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

Journal (Biology)

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Journal (Biology)

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Click here for the English version

Confocal Laser Skanning Mikroskopi Av Kalsiumdynamikk i Akutt Mus Bukspyttkjertelen Vev Skiver

Article DOI: 10.3791/62293-v

April 13th, 2021 •

Andraž Stožer¹, Jurij Dolenšek^1,2, Lidija Križančić Bombek¹, Viljem Pohorec¹, Marjan Slak Rupnik^1,3, Maša Skelin Klemen¹

¹Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, ²Faculty of Natural Sciences and Mathematics, University of Maribor, ³Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

April 13th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi presenterer forberedelsen av akutte bukspyttkjertelvev skiver og deres bruk i konfokal laser skanning mikroskopi for å studere kalsiumdynamikk samtidig i et stort antall levende celler, over lange tidsperioder, og med høy romlig løsning.

Transcript

I kombinasjon med levende cellekalsiumavbildning muliggjør den akutte vevsskiveteknikken i bukspyttkjertelen studiet av intercellulære bølger og multicellulær funksjonell tilkobling med høy oppløsning over lange tidsperioder. De viktigste fordelene med denne teknikken er at den er rask, bevarer vevsarkitektur og reduserer begrenset enzymatisk og mekanisk stress samtidig som det opprettholder et høyt utbytte av vev. Ved å oppdage funksjonelle og morfologiske endringer under sykdomsprogresjon, hjelper denne teknikken vår forståelse av bukspyttkjertelen relaterte sykdommer, for eksempel diabetes.

Denne vevsskiveteknikken kan brukes på hjerne-, hypofyse- og binyrevev med vekt på bevaring av intercellulær kontakt, parakriminelle interaksjoner og vevsarkitektur. For å forberede injeksjonen av agarose i musen bukspyttkjertelen, fyll en fem milliliter sprøyte med 40 grader Celsius væske agarose og utstyr sprøyten med en 30 gauge nål. Etter å ha dekket nålen forsiktig med en hette, plasser sprøytenålen ned, med hele volumet av agarose under vannoverflaten, i et 40 grader Celsius vannbad.

Boble en flaske ekstracellulær løsning med carbogen, kontinuerlig på is, på 1,5 milliliter per minutt ved barometrisk trykk og romtemperatur for å sikre oksygenering og en pH på 7,4. For å utføre agarose injeksjon plasser en euthanized voksen mus under et stereomikroskop og få tilgang til musens underliv via laparotomi. Beveg tarmen forsiktig til venstre side for å eksponere den vanlige gallekanalen og bruk tang til å løfte den tolvte enden av kanalen litt for å finne papillen til Vater.

Bruk en hemostat til å klemme gallekanalen på duodenal papilla for å forhindre lekkasje av agarose fra kanalen inn i tolvfingertarmen og bruk en liten skarp tang for å nå under den vanlige gallekanalen for å bryte membranen som fester kanalen til bukspyttkjertelen vev. Etter å ha fjernet så mye fett og bindevev fra kanalen som mulig, plasser kanalen vinkelrett på spissene til et par større tang, og trykk fast på sprøytestempelet, injiser den viskøse væsken agarose i den proksimale enden av den vanlige gallekanalen i 20 til 30 sekunder. Når vevet blir hvitt og litt distended fjerne sprøyten og sakte helle 20 milliliter av boblet iskald ekstracellulær løsning på bukspyttkjertelen for å avkjøle vevet og for å herde agarose.

For å skaffe bukspyttkjertelvev skiver bruke tang og fine tøffe kutt saks for å forsiktig overføre agarose injisert bukspyttkjertelen i en 100 millimeter Petri tallerken som inneholder 40 milliliter iskald ekstracellulær løsning. Virvle retten for å skylle vevet og overføre bukspyttkjertelen til en annen tallerken med iskald ekstracellulær løsning. Bruk tang og saks til å kutte den hvite, godt injiserte bukspyttkjertelen i opptil seks 0,1 til 0,2 kubikkcentimeter stykker og fjern eventuelt gjenværende bindevev og fettvev fra vevsstykkene.

Legg de rensede blokkene i en 35 millimeter ikke-klebrig bunn Petri-tallerken som inneholder omtrent fem milliliter 40 grader Celsius væske agarose og legg umiddelbart Petri-parabolen på is. Når agarose har herdet, hold Petri parabolen opp ned over lokket på en 100 millimeter Petri tallerken og bruk en halvdel av et barberblad for å forsiktig kutte i margen mellom den laterale veggen av Petri-parabolen og agarose for å fjerne agarose fra parabolen. Bruk barberbladet til å kutte individuelle terninger, som hver inneholder en vevsblokk av agarose, fra frigjort agarose og bruk cyanoacrylatlim for å feste blokkene til prøveplaten til en vibratom.

Fyll skjærekammeret til vibratomet med 150 milliliter iskald ekstracellulær løsning som kontinuerlig bobles med karbogen. Skru prøveplaten på vibratomet og monter et nytt barberblad. Omgi kammeret med is og tilsett to isbiter på 10 milliliter volum laget med ekstracellulær oppløsning supplert med seks millimolarglukose.

Sett sliceren til 0,05 til 1 millimeter per sekund og 70 hertz, og begynn deretter å kutte for å skaffe 140 mikron tykke agarose skiver med et 20 til 100 kvadrat millimeter overflateareal. Bruk en fin pensel til å overføre hver skive forsiktig til en 100 millimeter Petri-tallerken fylt med 40 millimeter HEPES-buffer supplert med seks millimolarglukose. For kalsiumfargepreparat, oppløs 50 mikrogram cellegjennomtrengelig kalsiumindikatorfargestoff, 7,5 mikroliter DMSO og 2,5 mikroliter poloksamer og 6,667 milliliter HBS i et 15 milliliter skruehetterør.

Bruk en pipette for å blande løsningen grundig i 20 sekunder før du nedsenker røret i et ultralydbadkammer og virvel, hver i 30 sekunder. Deretter aliquot 3.333 milliliter av den resulterende kalsium indikator fargestoff løsning i en 5 milliliter Petri parabolen per 10 skiver vev som skal merkes. For fargestoffbelastning, bruk en tynn myk pensel for å overføre opptil 10 vevskiver til hver tallerken fargestoffløsning og legg oppvasken på en orbital shaker i 50 minutter ved romtemperatur og 40 omdreininger per minutt beskyttet mot lys.

På slutten av inkubasjonen, overfør opptil 20 fargede skiver til individuelle 60 milliliter Petri-retter fylt med fargefri HBS. For kalsiumavbildning ved konfokal mikroskopi velg en 20 eller 25 ganger forstørrelse og sett oppkjøpsmodusen til tidsforløpavbildning, pinhole til 100 til 200 mikron, og eksitasjon og utslipp for fluoroforen som brukes i eksperimentet. Monter opptakskammeret og perfusjonssystemet på det temperaturkontrollerte stadiet av mikroskopet og plasser innløpet og utløpet på ytterkantene av opptakskammeret.

Sett tilstrømnings- og utstrømningshastighetene til en til to milliliter per minutt. Sett temperaturen på profusionsystemet til 37 grader Celsius og initier profusionen med den ikke-stimulerende løsningen. For å registrere kalsiumdynamikken i vevet plasserer du en enkelt vevsskive i opptakskammeret og immobiliserer vevet med en U-formet platinavekt med et stramt nylonnett.

Bruk lysfeltalternativet til å finne strukturen av interesse og bruke levende avbildning til å plassere de studerte strukturene i synsfeltet. Hvis du vil optimalisere signal-til-støy-forholdet, justerer du lasereffekten, detektorforsterkningen og linjegjennomsnittet for binning samtidig som lasereffekten holdes minimal. Juster fokusplanet til 15 mikron under den kuttede overflaten for å unngå opptak fra potensielt skadede celler og skaffe bildene.

Innstilling av samplingsfrekvensen til en til to hertz for å tillate første deteksjon av individuelle svingninger og opptak av et høyoppløselig bilde. Hvis det er tilgjengelig, kan du bruke et elektronisk diagram for å få umiddelbar tilbakemelding om forberedelsesresponsen, overbelysning, fotobleaching og mekanisk drift. Når alle bildene er samlet inn, lagrer du dataene for senere analyse.

Her kan et eksempel på en optimal vevsskive observeres der cellens gjennomtrengelige kalsiumindikatorfarge ble vellykket lastet inn i bukspyttkjertelen vevsskiven. I motsetning er disse vevsskivene ikke optimale for avbildning på grunn av enten en mislykket fargeinntrengning, mangel på holmeceller eller en overflod av nekrotisk vev på prøveoverflaten. Høyoppløselige bilder av en bukspyttkjertelvevsskive kan brukes til å avgrense forskjellige områder av bukspyttkjertelen vev, for eksempel holmer av Langerhans, acinar vev, eller bukspyttkjertelen kanal.

Stimuli kan brukes til å diskriminere mellom ulike holmeceller eller mellom holmeceller og ikke-holmeceller. For eksempel reagerer betaceller vanligvis på en firkantet pulsglukosestimulering ved å vise en forbigående økning i intracellulært kalsium etterfulgt av raske kalsiumsvingninger på et vedvarende platå. I motsetning reagerer ikke-betaceller med raskere og mer uregelmessige svingninger.

En forsinkelse i utbruddet av intracellulær kalsiumøkning etter stimulering, samt heterogenitet og forsinkelser blant individuelle celler kan også måles. De samme parameterne kan brukes til å beskrive deaktiveringsfasen. Her kan en skjematisk presentasjon av den intracellulære kalsiumoscillasjonsvarigheten, frekvensen og prosentandelen av aktiv tid observeres.

Ved avbildning ved oppkjøpsrater større enn 10 hertz, kan kalsiumbølger som gjentatte ganger sprer seg over holmen, tydelig gjenkjennes. Klem den vanlige gallekanalen så nær tolvfingertarmen som mulig for å forhindre at grenen som kommer inn i bukspyttkjertelen ved et uhell okkluderer. Ikke slutt å trykke stempelet under injeksjonen fordi agarose umiddelbart vil herdes i nålen.

Den akutte pankreasvevsskiveteknikken for mus kan også brukes med patchklemmemetoden for å studere ionkanalstrømmer og tilgang til cytose samt immunhiistokjemistudier og sekretærstudier.

X

Simple Hit Counter