Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Produktion av mänskliga CRISPR-konstruerade CAR-T-celler
Chapters
Summary March 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll för genredigering i primära mänskliga T-celler med CRISPR Cas Technology för att modifiera CAR-T-celler.
Transcript
Vårt laboratorieprotokoll möjliggör kombinationen av mänsklig genomredigering med CAR T-cellterapi. Laboratorieproceduren är metoden med CRISPR-Cas9 för att rikta in sig på upp till tre gener med hög effektivitet. Och slutligen kan vårt tillvägagångssätt översättas till kliniska prövningar på människa.
De beskrivna metoderna kan tillämpas på andra CAR-konstruktioner och målgener. Grunden för teknikerna är tillräckligt robust för att översättas till större skala och till akademiska och branschmedarbetare för vidare utveckling. När du försöker med det här protokollet för första gången begränsar du antalet grupper på guide-RNA-skärmen för att aktivera exakta inkubationstider.
Att följa kulturförhållandena och såddtätheten som beskrivits har visat sig vara avgörande enligt vår erfarenhet. Till att börja med, få autolog perifert blod mononukleära celler, eller PBMCs, från friska frivilliga givare och isolera CD4 och CD8 positiva T-celler med kommersiellt tillgängliga CD4 och CD8 urvalssatser. Kombinera CD4-positiva och CD8-positiva T-celler i ett förhållande mellan 1 och 1 och inkubera 3 miljoner celler per milliliter i R10, kompletterat med 5 nanogram per milliliter av varje mänsklig IL7 och human IL15 över natten vid 37 grader Celsius.
Nästa dag, räkna T-cellerna och centrifugera 5 till 10 miljoner celler vid 300 gånger G i fem minuter. Kassera alla supernatant och tvätta cellpelleten i reducerat serum minimalt essentiellt medium. Suspendera pelleten i 100 mikroliter kärnlösning enligt tillverkarens instruktioner.
När du tvättar cellerna, förbered ett ribonukleoprotein, eller RNP-komplex, genom att inkubera 10 mikrogram Cas9-nukleas med 5 mikrogram enkelguide RNA i 10 minuter vid rumstemperatur. Inkludera en falsk kontroll utan enkel guide RNA. Kombinera de återhängda cellerna med RNP-komplexet och tillsätt 4,2 mikroliter av fyra mikromolära elektroporationsförstärkare.
Blanda väl och överför till elektroporerings cuvettes. Elektroporera cellerna med pulskoden EH111, inkubera sedan 5 miljoner celler per milliliter i R10, kompletterat med 5 nanogram per milliliter mänsklig IL7 och mänsklig IL15 vid 30 grader Celsius i 48 timmar i 12 brunnsplattor. Efter inkubationen fortsätter du med T-cellsaktivering och expansion.
Designa sekvenseringsprimrarna genom att ange sekvensen av PCR-ampliconen till en standardprogram för primerdesign. Designprogramvaran kommer att föreslå flera primersekvenser som är lämpliga för Sanger-sekvensering. Välj framåt- och omvända primers som binder med ampliconen minst 150 baspar uppströms eller nedströms gRNA-skärplatsen för att säkerställa god sekvenseringskvalitet runt indelerna.
Använd TIDE-analys för att upptäcka knockouteffektivitet på genomisk nivå. Algoritmen rekonstruerar exakt spektrumet av indels från sekvensspåren och beräknar R kvadratiska värden. Efter aktivering utökas T-celler i kultur och kryopreserverade för framtida studier.
Under expansionen spåras befolkningsdubblingen och volymändringarna i hela protokollet för både falska och redigerade CAR T-celler. Inga betydande förändringar upptäcktes i spridningen och aktiveringen under expansionen. När cellerna var cryopreserved, nivåer av CAR uttryck fastställdes för ytterligare funktionella studier för både mock redigerade och knockout CAR T celler.
Inga betydande förändringar observerades. Knockout effektivitet kan bestämmas med hjälp av flera tekniker. I dessa representativa flöde cytometri tomter, PDCD1 och TRAC lokus riktades med hjälp av en enda guide RNA, visar en effektivitet på 90%för PDCD1 enda guide RNA och 98%för TRAC enda guide RNA över flera friska givare.
Det är viktigt att se till att molarförhållanden i Cas9 och guide RNAs är korrekta. Under proceduren ska cellerna alltid hållas vid fyra grader Celsius och inte lämnas kvar i elektroporeringslösningen under längre tidsperioder. Efter bilbevarande kan CRISPR-konstruerade CAR T-celler användas för funktionella analyser in vitro och in vivo, såsom cytotoxicitetsanalyser, cytokinproduktion och syngenetiska eller xenografiska tumörmusmodeller.
Vårt tillvägagångssätt med CRISPR Cas9-teknik tillämpas nu på kliniska prövningar. Tillvägagångssättet kan användas både för cancer, liksom för icke-maligna genetiska störningar, såsom hemoglobinofat, som påverkar miljontals barn och vuxna över hela världen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
