Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Produktion af humane CRISPR-manipulerede CAR-T-celler
Chapters
Summary March 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en protokol til genredigering i primære menneskelige T-celler ved hjælp af CRISPR Cas Technology til at ændre CAR-T-celler.
Transcript
Vores laboratorieprotokol muliggør kombinationen af human genomredigering med CAR T-celleterapi. Laboratorieproceduren er tilgangen med CRISPR-Cas9 til at målrette op til tre gener med høj effektivitet. Og endelig er vores tilgang i stand til at blive oversat til humane kliniske forsøg.
De beskrevne metoder kan anvendes på andre CAR konstruktioner og mål gener. Grundlaget for teknikkerne er robust nok til at blive oversat til større skala og til akademiske og industri samarbejdspartnere for yderligere udvikling. Når du forsøger denne protokol for første gang, skal du begrænse antallet af grupper på guide RNA-skærmen for at aktivere nøjagtige inkubationstider.
Overholdelse af kulturforholdene og såningstætheden som beskrevet har vist sig at være kritisk i vores erfaring. Til at begynde med skal du anskaffe autologe perifere blodmonnukleare celler eller PBPC'er fra raske frivillige donorer og isolere CD4- og CD8-positive T-celler ved hjælp af kommercielt tilgængelige CD4- og CD8-udvælgelsessæt. Kombiner CD4 positive og CD8 positive T-celler i et et til et forhold og inkubere 3 millioner celler per milliliter i R10, suppleret med 5 nanogram per milliliter af hvert menneske IL7 og menneskelige IL15 natten over ved 37 grader Celsius.
På den næste dag, tælle T-celler og centrifuge 5 til 10 millioner celler på 300 gange G i fem minutter. Kassér alle supernatant og vask cellepillen i reduceret serum minimal væsentlige medier. Suspendere pellet i 100 mikroliter af nuklear hengivenhed løsning i henhold til producentens anvisninger.
Under vask af cellerne, forberede en ribonucleoprotein, eller RNP kompleks, ved inkubation 10 mikrogram Cas9 nuklease med 5 mikrogram enkelt guide RNA i 10 minutter ved stuetemperatur. Medtag en mock control uden enkelt guide RNA. Kombiner de genophængte celler med RNP-komplekset, og tilsæt 4,2 mikroliter af fire mikromolar elektroporationsforstærker.
Bland godt og overfør til elektroporation cuvettes. Electroporate cellerne ved hjælp af puls kode EH111, derefter inkubere 5 millioner celler per milliliter i R10, suppleret med 5 nanogram per milliliter menneskelige IL7 og menneskelige IL15 ved 30 grader Celsius i 48 timer i 12 brønd plader. Efter inkubationen fortsættes med T-celleaktivering og udvidelse.
Design sekventering primere ved at indtaste sekvensen af PCR amplicon i en standard primer design software. Designsoftwaren vil foreslå flere primersekvenser, der er egnede til Sanger-sekventering. Vælg frem og omvendt primere, der binder med amplicon mindst 150 base par opstrøms eller nedstrøms af gRNA cut site for at sikre god sekventering kvalitet omkring indels.
Brug TIDE-analyse til at registrere knockout-effektivitet på genomisk niveau. Algoritmen rekonstruerer præcist spektret af indels fra sekvenssporene og beregner R-firkantede værdier. Efter aktivering udvides T-celler i kultur og kryopreserveret til fremtidige undersøgelser.
Under udvidelsen spores populationen fordobling og volumenændringer i hele protokollen for både mock og redigerede CAR T-celler. Der blev ikke konstateret væsentlige ændringer i spredningen og aktiveringen under udvidelsen. Når cellerne blev cryopreserved, niveauer af CAR udtryk blev bestemt til yderligere funktionelle undersøgelser for både mock redigeret og knockout CAR T celler.
Der blev ikke observeret væsentlige ændringer. Knockout effektivitet kan bestemmes ved hjælp af flere teknikker. I disse repræsentative flowcytometriområder blev PDCD1 og TRAC loci målrettet ved hjælp af enkelt guide RNA, der viste en effektivitet på 90% for PDCD1 enkelt guide RNA og 98% for TRAC single guide RNA på tværs af flere sunde donorer.
Det er vigtigt at sikre, at molarforholdet cas9 og guide RNA'er er nøjagtige. Under proceduren skal cellerne altid holdes på fire grader Celsius og ikke efterlades i elektroporeringsopløsningen i længere tid. Efter CAR-konservering kan CRISPR-konstruerede CAR T-celler bruges til in-vitro- og in-vivo funktionelle analyser, såsom cytotoksicitetsanalyser, cytokinproduktion og syngenetiske eller xenograph tumormusmodeller.
Vores tilgang ved hjælp af CRISPR Cas9-teknologi anvendes nu på kliniske forsøg. Tilgangen kan bruges både til kræft, samt en ikke-ondartet genetiske sygdomme, såsom hæmoglobinophaties, som påvirker millioner af børn og voksne over hele verden.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
