Intranasal immunisering og mælkeindsamling i undersøgelser af mødres immunisering hos newzealandske hvide kaniner (Oryctolagus cuniculus)

Undersøgelser af moderens immunisering og antistofoverførsel er uvurderlige af mange grunde, da dette er den første vej til immunitetsoverførsel og efterfølgende beskyttelse mod patogener og sygdomme hos nyfødte og spædbørn. På grund af ligheder i placentation og antistofoverførsel med mennesker er kaniner en fremragende model for moderimmunisering. I denne videoartikel demonstrerer vi teknikker, som vores laboratorium har brugt i undersøgelser af moderimation i New Zealand White Rabbits, herunder intranasal immunisering og mælkeindsamling.

Vi vil først beskrive et eksempel tidslinje og serie af begivenheder for en slimhinde moderens immunisering undersøgelse i New Zealand White Rabbits. Kvindelige kaniner immuniseres via intranasal ruten, som det fremgår af denne video. Afhængigt af undersøgelsen kan vaccinen kræve et løft eller muligvis skal gives gennem en ekstra rute, såsom intramuskulær immunisering.

Selv om det ikke er afbildet, bør blod indsamles forud for den indledende immunisering for baseline målinger, og i hele resten af undersøgelsen med jævne mellemrum. Blod opnås let ved den centrale ørearterie med mild sedation og et aktuelt smertestillende middel. Tilstedeværelsen af antigenspecifikke IgG-niveauer kan måles i disse prøver.

Kaniner opdrættes derefter. Vi foretrækker at købe dokumenterede opdrættere fra leverandører til brug for at sikre en højere graviditet sats for disse undersøgelser. Afhængigt af immunisering tidslinjen, kaniner kan modtage yderligere vaccinationer under hele graviditeten.

Antigenspecifik IgG overføres transplacentally til kits. På ca 30 til 32 dage efter avl gravid gør, vil fæng. Vi anbefaler, at du begrænser håndteringen af sættene i de første par dage for at minimere afvisningen fra gør.

Blodprøver kan indsamles fra kits til at vurdere antigen specifikke IgG niveauer, der blev overført transplacentally. Blod kan indsamles fra et lille antal kits på eller nær fødselstidspunktet for at vurdere tidlige antigenspecifikke antistofniveauer. Ud over en bred vifte af næringsstoffer, kits modtage antigen specifikke IgA fra ammende doe, mens sygepleje.

Kits er typisk fravænnede på fire til otte uger. Forud for fravænning mælk kan nemt indsamles fra ammende gør som påvist i denne video. De indsamlede mælkeprøver behandles derefter med henblik på påvisning af antigenspecifik IgA.

Afhængigt af undersøgelsen, vacciner og et løft kan administreres til kits og serielle blodprøver kan indsamles fra kits i en meget tidlig alder ved hjælp af lateral saphenous vene. Vi vil nu demonstrere intranasal immunisering og mælkeindsamling i New Zealand White Rabbits.Protocol. Alle procedurer blev godkendt og udført i overensstemmelse med Duke University Institutional Animal Care and Use Committee politikker.

Intranasal immunisering. Nødvendige materialer:Acepromazine, sprøjte og nål, oftalmisk smøremiddel, Isoflurane, næse kegle, pipette, og pipette tips, slimhindevaccine. Forbered immuniseringsopløsningen inden håndtering af dyr.

Kaniner bedøves med Acepromazine et milligram pr. Kg intramuskulært og bedøves med Isoflurane ved hjælp af en næsekegler. Når det er fuldt bedøvet som vurderet ved øjenlåg refleks, en oftalmisk smøremiddel tilsættes til hvert øje for at forhindre tørring af øjnene og efterfølgende hornhindesår. Når laboratoriemedlemmet er klar til at administrere vaccinen, og kaninen er i et passende anæstesiplan, skal du slukke for isofluranen og ilten og fjerne næsekeflen.

Placer kaninen i dorsal recumbency og prop hals og hoved på en omtrentlig 45 graders vinkel, der giver nem adgang til og visualisering af begge alars af lab medlem administrere vaccinen. Rørten må ikke fyldes med mere end 100 mikroliter af vaccineopløsningen, og opløsningen skal hurtigt administreres til ét næsebor, og proceduren for det andet næsebor gentages. Pipetten skal holdes i en omtrentlig 45 graders vinkel.

Vinkel mod det mediale aspekt af næsepassagen. Målet med immunisering er for opløsningen at kontakte slimhinderne i narerne. Spidsen bør derfor ikke placeres i narerne, da dette kan resultere i slid eller irritation af slimhindevævet og potentielt påvirke immunogeniciteten af den nasally administrerede vaccine.

Vaccinen skal administreres hurtigt og gøres på samme måde i det andet næsebor. Efter administration i begge næsepassager opretholdes kaninen i dorsal recumbency i 30 sekunder for at minimere lækage af vaccineopløsningen. Laboratoriet vil typisk ikke administrere mere end 100 mikroliter pr. næsebor ad gangen.

Hvis et større volumen skal administreres med et maksimalt samlet volumen på 500 mikroliter, kan vaccinen gives i 100 mikroliter aliquots med en hvileperiode på 30 sekunder mellem immuniseringer. Og yderligere administrationer af vaccine gentaget med 30 sekunders hvile mellem hver administration, indtil den samlede vaccine volumen er leveret. Efter immunisering skal du placere kaninen på ventrum til genopretning og nøje overvåge dyret, indtil det er i stand til at opretholde sternal recumbency.

I nogle tilfælde kan vaccineformuleringen ikke leveres helt til næsehulen, og en del af vaccineformuleringen kan forblive på den udvendige del af narerne. I dette tilfælde, fordi det ikke er klart af den nøjagtige mængde af vaccinen, der blev korrekt leveret til næsehulen, anbefaler ikke genansøgning af yderligere vaccinemateriale, da dette ville tilføje en udefineret variabel til eksperimentet. Det er vigtigt at bruge en vaccine levering teknik, der giver fuldstændig og konsekvent levering af vaccinen formulering til nares.

Mælkeindsamling. Nødvendige materialer:Acepromazine, sprøjter og nåle, alkoholpind, gaze, oftalmisk smøremiddel, Isoflurane, næsekegle, oxytocin og et indsamlingsglas. Kaniner bedøves med Acepromazine et milligram pr. Kg intramuskulært og bedøves med Isoflurane ved hjælp af en næsekegler.

Når det er fuldt bedøvet som vurderet ved øjenlåg refleks, en oftalmisk smøremiddel påføres hvert øje for at forhindre tørring af øjnene og efterfølgende hornhindesår. Rengør huden over den marginale øreåre med alkoholpinden. Ved hjælp af en en mil sprøjte og 25 gauge nål, administrere ca en til to internationale enheder af oxytocin intravenøst af den marginale øre vene til at fremkalde mælk svigtet.

På grund af den glatte muskelafslapning er det almindeligt, at kaninen urinerer eller afføring efter administration af oxytocin. Efter oxytocin administration, lægge pres på injektionsstedet med et stykke gaze til at give hemostase. Mens du opretholder anæstesimasken eller næsekeglerne over kaninens næse, skal du støtte kaninen op på bagkvarteret.

Som en side bemærkning, kan mælk indsamling også udføres med dyret i lateral recumbency, men laboratoriet konstaterer, at indsamlingen er lettere, når kaninen er understøttet op på det rump med en assistent holder kanin oprejst med anæstesi maske. Åbn det sterile rør for at forberede mælkeopsamlingen og find brystvævet og tilhørende patter. Kaniner har typisk fire til fem par brystkirtler.

Patterne er typisk omgivet af våd pels fra nyere sygepleje og brystvævet er let håndgribeligt, når det er fuld af mælk. Tag fat i brystvævet, der er forbundet med patten mellem tommel- og pegefingeren, og påfør et blidt masseretryk på kirtelvævet i retning af patten. Placer opsamlingsrøret over patten for at indsamle den udtrykte mælk.

Det kan nogle gange tage flere minutter for oxytocin at være effektiv, og mælkeproduktionen synes at variere blandt brystkirtlerne. Hvis mælkeudtrykket ikke lykkes, skal du vente flere minutter eller rotere rundt til en ekstra brystkirtel. Mælk fra alle patter kan opsamles i samme modbydelige.

Typisk flere milliliter mælk kan nemt indsamles fra en ammende doe. Når den ønskede mængde mælk er indsamlet, skal du slukke isofluranen og ilten og fjerne næsekeglerne fra kaninen og lade kaninen komme sig, mens den overvåges nøje, indtil dyret er i stand til at opretholde sternal recumbency. Repræsentative resultater.

Figur et. For mødre undersøgelser, bestemmelse graviditet så tidligt som muligt er nyttigt at bekræfte, at doe ikke behøver at blive opdrættet igen. Muligheder for graviditetsdetektion omfatter palpation, ultralyd, røntgenbilleder, vægtøgning og molekylære teknikker såsom målinger af insulinvækstfaktorer og progesteron.

Tilstrækkelige progesteronniveauer er nødvendige for vedligeholdelse af graviditet hos kaniner. Derfor har flere undersøgelser også vurderet progesteronniveauer hos gravide kaniner og påvist forhøjede niveauer i forhold til ikke-gravide kaniner, især under organogenese omkring midten af svangerskabet. Som vist i figur et, forhøjede progesteron niveauer kan påvises hos gravide kaniner i forhold til ikke-gravide kaniner, selv efter parringer af en sorteper blev bekræftet for alle gør.

Serum progesteron niveauer blev målt ved hjælp af en automatiseret chemiluminescent assay. Figur to. Antigenspecifik IgG, der blev overført transplaceret under svangerskabet, kan måles i Elisa’s serum af sættene.

Blod kan indsamles fra et lille antal kits på eller nær fødselstidspunktet for at vurdere tidlige antigenspecifikke antistofniveauer. Seriel blodopsamling er teknisk meget lettere som kits alder og stigning i størrelse. Som afbildet i figur to kan serumniveauer af antigenspecifik IgG i sættene måles og sammenlignes med moderens niveauer.

Maternally overført IgG niveauer er højere ved fødslen og falde over tid. Figur tre. Kaninmælk kan indsamles som vist i denne video og behandles for at måle det samlede og antigenspecifikke antistofniveauer af Elisa.

Som vist i dette tal udgør IgA en betydelig del af de samlede antistoffer i modermælken, der er tilgængelige for passiv overførsel til kits. Både IgA- og IgG-niveauerne er betydeligt højere end IgM.Summary. Denne videoartikel beskriver og demonstrerer administrationen af intranasale vacciner og indsamling af mælk fra ammende kaniner som et middel til at vurdere slimhindeimmunitet i en translationelt passende model for moderimmunisering.

Afbildet er et resumé billede for en typisk maternel intranasal immunisering undersøgelse design indarbejde immuniseringer, avl, optænding, amning, og antistof overførsel.