Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Forberedelse af prøvestøttefilm i transmissionselektronmikroskopi ved hjælp af en støtteflådsblok
Chapters
Summary April 8th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Prøveforberedelse til kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er en betydelig flaskehals i strukturbestemmelsesarbejdsgangen for denne metode. Her giver vi detaljerede metoder til brug af en brugervenlig, tredimensionelt trykt blok til fremstilling af støttefilm for at stabilisere prøver til transmission EM-undersøgelser.
Transcript
Her præsenterer vi forbedrede protokoller for at forberede cryo-EM prøver med støttefilm ved hjælp af en ny flotationsblok, der letter håndteringen af sådanne delikate film. Den største fordel ved denne metode er, at prøven er beskyttet mod luftvandsgrænsefladen, hvor skadelige virkninger som denaturering kan forekomme. En af de protokoller, der præsenteres her undgår enhver form for dyr behandling for at gøre graftegning hydrofil, derfor øge sin tilgængelighed til hele EM samfund.
Små flydeanordninger er endnu ikke meget udbredt af elektromikroskopi til god forberedelse. Så disse visuelle demonstrationer kan give et benchmark for deres brug. Til at begynde med skal du vaske TEM-gitrene med dobbelt destilleret vand og ethelacetat efterfulgt af plasmarensning.
Derefter tilsættes 10 til 12 mikroliter af prøven i bufferudvekslingsboen godt, flotationsblokken og 10 til 12 mikroliter af 2% urinalacetatopløsning i den tilstødende ikke-bufferbytte godt til negativ farvning. Det er vigtigt at tage passende sikkerhedsforanstaltninger, når du arbejder med plet. Skær forsigtigt to små stykker glimmer med forudbestemt carbonfilm på toppen.
Sørg for, at glimmerfragmenterne er brede nok til at passe ind i brønden og længere end brøndlængden, således at fragmentet kan sidde på brønden, mens kulstofet flyder, og der er plads nok til at håndtere fragmentet med pincet. Sænk glimmer i brønden med en omtrentlig vinkel på 45 grader, indtil glimmer sidder på rampen af brønden og kulstoflaget observeres på overfladen af den flydende prøve. Efter inkubation af kulstof med prøve, trække glimmer ark meget langsomt at inddrive carbon film og for at minimere den resterende viscus prøve fastholdelse.
Blot forsigtigt glimmer ved at trykke på den nedre ikke-kulstofmæssige overflade med et filterpapir for at fjerne den overskydende væske og nedsænke glimmerfragmentet i den modsatte brønd, der indeholder 2% urinalacetatopløsning for at udveksle kulstoflaget med den negative plet. Genvind det flydende kulstoflag med den hellige kulstofdækkede side af vasket og plasmarenset EM-gitteret. Lad derefter gitrene lufttørre indtil billeddannelse på TEM, helst dække dem for at undgå luftbåren forurening.
Efter rengøring af TEM-gitre som tidligere påvist skal grafenoxidaffjedringen forberedes lige før brug og hvirvle grundigt. Derefter tilsættes 10 til 12 mikroliter af grafenoxid suspension i de fire ikke buffer udveksling brønde. langs flydeblokken.
Tilsæt 10 til 12 mikroliter dobbelt destilleret vand eller ultra rent vand i de resterende fire buffer udveksling brønde af blokken. Drop fire gitre forsigtigt på grafenoxid suspension af hver brønd og inkubere i et minut for at sikre, at den hellige kulstof dækket side er i kontakt med opløsningen. Efter et minut skal du genvinde hvert gitter omhyggeligt ved at skubbe pincet ind i pincet rillen af hver ikke buffer udveksling godt.
Skub forsigtigt og kort kobberets ikke-kulstofdækkede side af hvert gitter med det dobbelte destillerede vand i den tilstødende brønd, indtil vanddråben er synlig på gitteret. Hold derefter forsigtigt gittervandsdråbet på hovedet mod et stykke filterpapir. Dæk gitrene og lad dem i pincet til lufttørre.
Placer fire vaskegitre oven på et kobbergrafark deponeret på et glas dias, og dække hvert gitter med en dråbe isopropanol at tillade intim kontakt mellem monolayer graphene og nettet. Efter fuldstændig fordampning af isopropanolen skal kobbergrafenarket flydes med gitre på jernchloridopløsningen i glas petriskålen. Dæk derefter skålen for at undgå luftbåren forurening og lad den ætse ved stuetemperatur natten over.
Brug en løkke med diameteren større end TEM gitter størrelse til at fiske ud gitre flyder på grafen monolag og omhyggeligt overføre dem til et glas Petri fad indeholder dobbelt destilleret vand til vask. Vask gitrene to gange i vand, og overfør nettene til en petriskål, der indeholder prøvebuffer, indtil prøveforberedelsen og dykfrysningen. Tilsæt 10 til 12 mikroliter af prøven i en brønd af flydeblokken.
Når prøven er klar i blokken, skal du vælge det grafenbelagte gitter fra bufferopløsningen ved hjælp af et par rene pincet og placere den på overfladen af prøven, der indeholder brønden. Efter en passende inkubationsperiode skal du afhente gitteret med et par rene frysende pincet og fortsætte med blotting og vitrifikation. Negativt farvede gitre tilberedt med støtte flotation blok er typisk dækket med amorf kulstof på tværs af hele gitteret overfladen.
Mens brud på carbonfilmen forekommer i nogle tilfælde, er et stort antal gitter firkanter uberørte og gælder derfor til negative farvningsformål. På samme måde opnås god filmdækning rutinemæssigt på tværs af hele nettet ved hjælp af grafenoxidprotokollen. Grafenoxidgitre kan fremstilles hurtigt af råmaterialer og er meget beskyttende for prøven.
At holde grafen våd og prøve påføring in situ lige før frysning er tilstrækkelig til at generere egnede islag til kryo-EM. Denne protokol kræver ikke udstyr til at gøre grafen hydrofil og giver en fordel for prøvegendannelse. Støtte flotation blok har to nåleporte på stedet for hver brønd, der tillader buffer udvide i C2, som er meget nyttigt for prøver afledt af glycerol gradienter.
Flotationsblokken har gjort det muligt at udforske på gitteraffinitetsrensningsmetoder ved at udnytte kontrollerbar bufferstrøm af små mængder samt funktionaliserede støttefilm.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
