Login processing...

JoVE Journal
Cancer Research
Author Produced

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Cancer Research

Sirkulerende tumorcellelinjer

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Journal (Cancer Research)

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

Journal (Cancer Research)

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

Click here for the English version

Sirkulerende tumorcellelinjer: et innovativt verktøy for grunnleggende og translasjonell forskning

Article DOI: 10.3791/62329-v

December 25th, 2021 •

Guillaume Belthier*¹, Zeinab Homayed*¹, Céline Bouclier¹, Muriel Asari¹, Julie Pannequin¹

¹Department of Physiology and Cancer, Institute for Functional Genomics, Montpellier University

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

December 25th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Culturing CTCs tillater en dypere funksjonell karakterisering av kreft, gjennom å analyse spesifikke markør uttrykk, og vurdere narkotikaresistens og evnen til å kolonisere leveren blant andre muligheter. Samlet sett kan CTC-kultur være et lovende klinisk verktøy for personlig medisin for å forbedre pasientutfallet.

Transcript

Metastase er en ledende årsak til kreftrelaterte dødsfall. Dette fenomenet oppstår når kreftceller løsner fra den primære svulsten, går inn i blodsirkulasjonen for endelig å nå et fjernt målorgan. Når disse frittliggende cellene går inn i blodet, kaller vi dem sekundære tumorceller.

De representerer et variabelt materiale fordi de på den ene siden er den viktigste skyldige i metastasedannelse, og i den annen side er de lettere enn tumorbiopsier. Faktisk kan de samles av en enkel blodpunktering. Til tross for det lave antallet av disse cellene i blodprøven, er vi de første til å etablere flere sirkulerende tumorcellelinje fra pasientens blod med større bekymring ved hjelp av den 3D-kontrollerte tilstanden.

Denne cellelinjen kan brukes på en hvilken som helst kommersiell cellelinje for rutinemessig eksperiment. For eksempel, for genetisk legemiddelscreening, til protein av interesse, men også for in vivo-eksperiment for å teste tumorinitieringskapasiteten og deres metastatiske potensial. CTC, sirkulerende tumorcellelinjer, bør dyrkes under 3D-forhold i hypoksi.

Når CTC har dannet sfærer, kan vi sette den i mediet og sentrifugere den i fem minutter ved 300 RCF. Kast supernatanten og tilsett 500 mikroliter Accumax. Vi suspenderer en og inkuberer løsningen 20 minutter ved 37 grader.

Vask deretter dissosierte sfærer med PBS og pellet cellene. Resuspend pellet med en nysupplert DMEM / F12 og se cellene i tettheten av fem celler per mikroliter i en ny 24 Lav Vedlegg plate. Sentrifuge CTCer eliminerer supernatanten og vasker pellet to ganger med PBS.

Ved 500 mikroliter PFE bland godt og inkuber røret på is i 20 minutter. Deretter sentrifugerer du de faste sfærene og vasker pellet to ganger med PBS, eliminerer det maksimale volumet av PBS og legger til 20 mikroliter dannet HistoGel. Ta det til suspensjon og lag en dråpe på kulturvasen, la den tørke i 10 minutter og løsne den ved hjelp av en skalpell.

Du kan nå behandle for ethvert ønske for å CTCer rettet mot et ønsket protein av interesse. Samle CTCer og opphev tilknytningen til sfærene med Accumax som tidligere beskrevet. Eliminer Accumax og resuspend pellet med tre ml blokkering buffer og overføre suspensjonen gjennom en 14 mikrometer celle sil for å oppnå encellet løsning.

Tell cellene og send inn i rør og legg til et volum på 200 000 celler, sentrifuger rørene og kast supernatanten. I følge antistoffdatabladet legger du til et rør, ønsket volum av antistoffet og i et annet rør isotypen og fortsetter trinnene etter produsentens veiledning. Det gjenværende røret vil ikke bli merket, og bruken av et levedyktighetsmarked er sterkt foreslått i dette eksperimentet.

På cytometeret starter du med det ikke-merkede røret for å stille inn spenningen i det negativt merkede området. Deretter plasserer du isotyperøret. Isotypen vil fungere som en negativ kontroll for å skille mellom det positive signalet og ikke-spesifikt signal.

Og fullfør eksperimentet med de merkede cellene med antistoffet av interesse der du bør se et skifte i den positivt merkede porten, hvis proteinet av interesse uttrykkes. Dette suspenderer dissosierte CTCer i supplert medium med tettheten på 200 000 celler per ml. I et Ultra Low-tilbehør 96, brønnplate, forsegle volumet på 50 mikroliter og inkuber platen 24 timer i hypoksi.

Neste dag, tilsett 50 mikroliter av forskjellig konsentrasjon av det testede stoffet og tilsett samme volum DMEM / F12 bare for å ytterligere bestemme basen av cellulær levedyktighet og inkubere platen i ytterligere 48 timer. På dag tre rekonstituerer du midlet og tilsetter 70 mikroliter av blandingen i hver brønn. Sett platen på en orbital shaker i 20 minutter og mål deretter luminescensen.

Denne analysen er et nyttig verktøy for å teste et stort antall legemidler for å evaluere effektene på CTCs cellevekst. I Eppendorf klemmer resuspendceller i 100 mikroliter PBS huden på baksiden av musen og setter inn nålen under huden. Injiser sakte hele volumet på samme sted og overvåk tumorvekst annenhver dag og ofret musene hvis svulsten oversteg en størrelse på 1,5 kubikkcentimeter.

Før operasjonen, injiser subkutant en smertestillende, på den dorsale ventrale siden av musen, gjør et lite snitt under den tiende ribben. Løft milten forsiktig ut og legg den på en steril gasbind. Bruk en insulinsprøyte, injiser 50 mikroliter resuspenderte CTCer i PBS og vent i tre minutter uten å fjerne kanylen.

Ligate arterielle fartøyet fra den ene siden og venalfartøyet fra den andre siden. Fjern deretter milten ved å skjære rett over de to ligaturene. Sy bukperitoneum og huden og desinfiser godt området.

Målet med dette eksperimentet er å teste kapasiteten til CTCer avledet fra kolorektal kreftpasient for å kolonisere leveren ved å indusere, synlig metastatisk fremsyn. Isolering og etablering av klinikken tumorcellelinjen er et fremvoksende verktøy for både grunnleggende og translasjonelle studier. For eksempel, hvis du har et gen av interesse der in vivo-studiene viste at dette genet er involvert i migrasjon og invasjonskapasitet av kolorektal kreftcellelinjer, kan det være et godt verktøy å bekrefte resultatet i vivo.

For translasjonsstudier er vårt hovedperspektiv med å isolere sirkulerende tumorcellelinjer å bruke dette dyrebare materialet i personlig medisin. Fra pasientens blodprøver ville vi isolere og forsterke CTCer i kultur i to eller tre uker for å ha nok materiale til å screene panelet av legemidler som er tilgjengelige og vurdere cytotoksisiteten til endelig å tilskrive

X

Simple Hit Counter