This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie
Summary November 20th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.
Transcript
Deze video zal zich richten op de bereiding van gist salmonella voor cryo-elektronentomografie We zullen de workflow doorlopen van celteelt tot cryo-elektronentomografie Saccharomyces cerevisiae worden gekweekt voor ionenmonstervoorbereiding in suspensie Het wordt aanbevolen om in steriele omstandigheden te werken in de laminaire flowbox tien milliliter steriele gist geëxtraheerd tot medium voor celkweek wordt toegevoegd om kweekkolf te steriliseren een milliliter steriele twintig procent glucose wordt toegevoegd aan de kolf met teeltmedium één gistkolonie wordt zorgvuldig van onze teeltplaat geplukt en overgebracht naar het bereide groeimedium in de kweekkolf wordt vervolgens afgedekt met folie en goed gemengd om cellen te verspreiden celcultuur wordt in de incubator geplaatst en gekweekt op dertig graden met constante agitatie totdat de exponentiële fase is bereikt gistcelcultuur wordt gekweekt tot exponentiële fase en celfysicadichtheid wordt gemeten door het vasthouden van de meter tegen een schoon medium als een referentiemonstercelcultuur wordt geconcentreerd op OD1 of OD30 naast vijf procent glycerol voor blanche bevriezing Elektro-microscopische rasters oppervlak wordt gereinigd en geactiveerd voor toepassing van celsuspensie door plasmaroosters worden geplaatst in gloeiende ontladende kamer tegenover koolstofzijde omhoog en procedure van plasmareiniging is ingesteld op dertig tot vijfenveertig seconden EM-rasters hebben nu en ze zijn klaar voor cel monstertoepassing Vitrificatie van gistcelsuspensie op EM-roosters wordt gedaan door blanche invriezen in het vloeibare ethaan met behulp van Vitrobot-machine De bereiding van vloeibaar ethaan vindt plaats door ethaangas vloeibaar te maken in een metalen beker gekoeld met vloeibare stikstof EM-rooster met celsuspensie wordt van de achterkant afgeveegd door filterpapier en door niet-klevend plastic gebogen vanaf de voorkant koolstofzijde Temperatuur in de Vitrobot-kamer is ingesteld op achttien graden en vochtigheid tot honderd procent wachttijd, vlektijd en vlekkracht worden ook ingesteld op Vitrobot-scherm Het gloeiafvoerrooster wordt door Vitrobot-pincetten geplukt en op het instrument gemonteerd driepunts vijf microliter Saccharomyces cerevisiae-suspensie wordt aangebracht op de koolstofzijde van het rooster in de Vitrobot-klimaatkamer De ophanging moet goed worden gemengd voordat elke toepassing van het rasterrooster wordt bevroren in de vloeibare ethaan elektro-microscopie roosters met verglaasde cellen worden opgeslagen onder vloeibare stikstof omstandigheden of gemonteerd in het rooster patroon voor het laden in de cryo SEM microscoop Raster met verglaasde cellen wordt vervolgens bevestigd in het rooster patroon geschikt voor het laden van zowel SEM en TEM microscopen C-clip ring wordt gemonteerd op het knipgereedschap en afgekoeld in vloeibare stikstof rooster wordt geplaatst op rooster cartridge koolstof naar beneden gericht en geknipt met de C-clip ringmonster wordt vervolgens in de speciale rasterdoos geplaatst Monster voor lamila-voorbereiding wordt geladen op dual beam FIB / SEM-microscoop en past met cryo-stage voorbereidingskamer laadpot wordt goed gekoeld en gevuld met vloeibare stikstof monsterhouder genaamd shuttle wordt in de en afgekoeld evenals roosterdoos met monster wordt overgebracht van de opslag dewar naar de pot en roosters worden in twee sleuven in de shuttle carbon kant met cellen naar boven gericht in geval van gebruik van FIB-rasterpatronen de uitsnijding van de roosterpatroon moet zorgvuldig worden uitgelijnd tot twaalf uur in de shuttleroosters worden aangedraaid door de schroef en de shuttle wordt neergedraaid naar laadpositie laadpot wordt geplaatst in het overslagstation en bedekt met deksel Transferkamer met laadpot wordt op de bovenkant van het deksel geplaatst en door de lage vacuüm shuttle met roosters wordt bevestigd op de staaf en gesloten in de kleine transferkamer kamers verzameld naar de voorbereidingskamer worden gepompt en shuttle wordt ingebracht op cryo-fase in hoogvacuüm SEM kamertrap wordt gekanteld tot vijfenveertig graden en verplaatst vier millimeter op de middelste positie van het rooster het inbrengen van de naald van gasinjectiesysteem creëert beschermende laag organisch op biologisch monster tegen stralingsschade tijdens gerichte gerichte ionenbundel freesroosters worden vervolgens gesputterd met dunne sluier van anorganisch metaal om geleidende laag op biologisch materiaal te creëren gericht ionenbundelfrezen van lamellen in celcluster of monolaag wordt in enkele stappen gedaan fase wordt verplaatst naar freeshoekgebied van belang wordt gevonden en boven- en onderfreespatronen worden gemaakt ruwe lamellen worden gefreesd met geleidelijke afname van FIB-stroom en lamellendikte het uiteindelijke polijsten van lamellen is alleen uitgevoerd met bovenste patroon en lage FIB-stroom om schade aan de voorkant en gordijneffect op lamellenoppervlak elektronenbundel te voorkomen toont de voortgang tijdens het freesproces hier kunnen we de uiteindelijke gepolijste lamellen zien De uiteindelijke dikte van lamellen moet minder dan tweehonderdvijftig nanometer zijn om transparant te zijn voor transmissie van elektronenbundel de illustratie van lamellen gefreesd in celcluster en monolaag met voor- en nadelen van beide monstertypen roosters met lamali worden zeer voorzichtig overgebracht door de voorbereidingskamer terug naar de laadpot pot wordt afgekoeld en gevuld met verse en schone vloeibare stikstof om ijsverontreiniging van gefreesde lamali-roosters te voorkomen, worden uit de shuttle verwijderd en teruggebracht naar de rasterdoos monster met gefreesde lamali wordt uiteindelijk overgebracht naar transmissie-elektron cryomicroscooprooster moet negentig graden worden gedraaid voordat het in de TEM autoloader-cassette wordt ingebracht om te zorgen voor een goede oriëntatie van de lamellen ten opzichte van de TEM-kanteltoegang Lamili worden gescreend en het gebied van belang voor het verkrijgen van cryo-elektron tomografische gegevens is gelokaliseerd Lamella hoofdas staat loodrecht op de kantelas van de microscoop om het juiste gezichtsveld te zien bij hoge kantelhoeken dosimetrische methode wordt gebruikt om cryo-elektrontomografiegegevens te verzamelen verzameld tomogram wordt vervolgens verwerkt in Etomo-software en monolaag gesegmenteerd in Amira software In dit protocol hebben we u laten zien hoe u efficiënt een gistcelmonster kunt bereiden voor een lamellenmicromachine met behulp van cryo-gericht ionenbundelfrezen en hoe u elektronentomografiegegevens en cel lamali kunt voorbereiden en verwerken
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
