Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא
Chapters
Summary April 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
מתואר כאן פרוטוקול מיצוי DNA באמצעות חרוזים מגנטיים כדי לייצר עקירות DNA באיכות גבוהה יתושים. עקירות אלה מתאימות לגישת רצף של הדור הבא במורד הזרם.
Transcript
פרוטוקול מיצוי DNA מבוסס חרוזים מגנטיים זה, המבוסס על תקציב, הופך רצף תפוקה גבוה לנגיש למעבדות ומחקרים מוגבלים במשאבים. פרוטוקול זה אינו דורש ציוד יקר להפקת DNA באיכות גבוהה והוא יכול להיות מועיל במצבי אבחון או מחקר מסוימים שבהם השגת כמות מספקת של DNA עם איכות עבור ריצוף תפוקה גבוהה היא מאתגרת. קל לשכפל פרוטוקול זה באמצעות הדגמה חד-פעמית.
יש לנסות עם מספר קטן של דוגמאות תחילה כדי להכיר את זרימת העבודה. בתור התחלה, לחות דגימות רקמת היתוש המאוחסנות ביותר מ 70% אלכוהול על ידי הוספת 100 microliters של מים כיתה PCR ודגרה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לרכך את הרקמה. לאחר הדגירה, להשליך את המים ולהוסיף 100 microliters של תערובת אנזימי חיץ Proteinase K.
ואז להשתמש עלה צינור microcentrifuge כדי הומוגניזציה הרקמה. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה הרקמה ליסייט ודגרה במשך שעתיים עד שלוש שעות ב 56 מעלות צלזיוס. כדי לחלץ דנ"א, פיפטה 100 מיקרוליטרים של הרקמה מתמוססים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי חדש.
לאחר מכן להוסיף 215 microliters של תערובת מאסטר חרוז מגנטי. באמצעות פיפטה, מערבבים את תערובת החרוזים המגנטיים במשך 10 עד 20 שניות, ואז נותנים לו לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, לנער בעדינות את הצינור מדי פעם כדי למקסם את הכריכה של ה- DNA חרוזים מגנטיים.
לאחר מכן, מניחים את הצינור על מפריד החרוזים המגנטי עד שהתמיסה מתבהר. לאחר מכן, בעזרת פיפטה, שאפו בעדינות את הנוזל מהצינור מבלי להפריע החרוזים המגנטיים המחזיקים בדנ"א. הזז את הצינור ממפריד החרוזים המגנטי ושטוף את החרוזים על ידי הוספת 325 מיקרוליטרים של חוצץ כביסה אחד.
מערבבים היטב על ידי צנרת ודגרה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, מניחים את הצינור על מפריד החרוזים המגנטי ומסירים את supernatant כפי שהוכח בעבר, ולאחר מכן להזיז את הצינור מן מפריד החרוזים המגנטי לשטוף את החרוזים פעם אחת עם חוצץ כביסה אחד. לאחר השטיפה השנייה עם חוצץ אחד, לשטוף את החרוזים פעמיים עם 250 microliters של חוצץ כביסה שני באותו אופן.
לאחר הכביסה האחרונה, להזיז את הצינור מן מפריד החרוזים המגנטי ולהוסיף 100 microliters של חוצץ elution. מערבבים ביסודיות על ידי צנרת ולאחר מכן לדגור על הצינור במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר לפני הנחת אותו בחזרה על המפריד המגנטי. כאשר הפתרון מתבהר, להעביר את supernatant לתוך חדש, נקי 0.5 מיליליטר microcentrifuge צינור ולאחסן כראוי.
מוצג כאן כקריאת פלואורומטר מיקרו-וולטום טיפוסית של הדנ"א של היתוש במאגר אלוטיון המכיל 0.5 מילימול EDTA. יחס הספיגה הממוצע של 260 עד 280 ננומטר הוא 2.3. טבלה זו מציגה את העלויות ואת מספר הדגימות המעובדות ביום עבודה אחד עבור שיטות מיצוי שונות.
העלות ריאגנט טיפוסי מתכלה עבור מיצוי על ידי פרוטוקול זה הוא סביב 9.50 לכל מדגם. עלות זו שקולה לכל שיטת מיצוי אופיינית המבוססת על חרוז מגנטי. היתרון העיקרי של העלות של פרוטוקול זה נובע מאי-צורך במכשיר מיצוי DNA אוטומטי.
הקפד לשנות טיפים pipette בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב של DNA בעת עבודה עם דגימות מרובות. אנו משתמשים בדנ"א באיכות גבוהה המופק בשיטה זו לרצף גנום שלם. אנו משתמשים כעת בנתוני הרצף כדי לזהות מוטציות חדשניות בעמידות לחומרי הדברה או בגנים חיסוניים של דאגה בבריאות הציבור ובקרת מחלות.
פתרונות במחירים סבירים לרצף תפוקה גבוה פותח דלתות מרגשות לגנומיקה של האוכלוסייה וגנומיקה נוף שמטרתן להבין את פיזור היתושים ואת זרימת הגנים המשפיעה על הצלחתן של אסטרטגיות בקרה גנטיות חדשניות רבות.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
