Immunology and Infection
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Análisis de la composición lipídica de micobacterias por cromatografía de capa delgada
Chapters
Summary April 16th, 2021
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Se presenta un protocolo para extraer el contenido total de lípidos de la pared celular de una amplia gama de micobacterias. Además, se muestran protocolos de extracción y análisis de los diferentes tipos de ácidos micólicos. También se proporciona un protocolo cromatográfico de capa delgada para monitorear estos compuestos micobacterianos.
Transcript
Micobacterias Los lípidos son una característica importante del género y son críticos en las interacciones de las micobacterias huéspedes. Rapidez y versatilidad son las principales ventajas de este procedimiento. Este método se puede utilizar para comprender el papel de los lípidos y la patogenicidad de las micobacterias y su efecto inmunoestimulante.
Para la extracción de lípidos ligados no covalentes, agregue 15 mililitros de una a dos soluciones de cloroformo a metanol a un tubo de vidrio con una tapa de rosca de revestimiento de PTFE debajo de una campana de flujo laminar. Luego, rasque 200 miligramos de micobacterias de un medio sólido y agregue las micobacterias al tubo de vidrio. Incubar el tubo durante la noche con agitación constante.
Al día siguiente, filtre los disolventes orgánicos a través de un embudo de vidrio forrado con papel de filtro en un tubo de vidrio. Después de usar el flujo de gas nitrógeno, para evaporar la fase líquida en el tubo, llene el tubo con gas nitrógeno, para almacenar el tubo a cuatro grados centígrados. Luego, agregue 15 mililitros de una solución de cloroformo de dos a uno a metanol a los desechos celulares e incube el tubo durante la noche con agitación constante.
A la mañana siguiente, deje reposar la mezcla durante una hora, antes de usar una pipeta Pasteur para transferir los disolventes orgánicos a un embudo de vidrio forrado de papel de filtro en el mismo tubo de recolección de vidrio. Luego, evapore la fase líquida como se ha demostrado, antes de rellenar el tubo con gas nitrógeno durante cuatro grados centígrados de almacenamiento. Para la extracción de ácido micólico, agregue de dos a cinco mililitros de una solución agitadora y 200 miligramos de biomasa de micobacterias a un tubo de vidrio hermético con una tapa de rosca de revestimiento de PTFE, y mezcle el contenido mediante vórtice.
Incubar la mezcla dentro de un baño seco a 80 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, cuando el tubo se haya enfriado a temperatura ambiente, agregue dos mililitros de N hexano y mezcle el contenido durante 30 segundos mediante vórtice. Deje que el tubo se asiente hasta que aparezcan dos fases claras y transfiera la fase superior de hexano N a un nuevo tubo.
Mezcle dos mililitros adicionales de N hexano con el contenido del tubo y recoja la capa superior nuevamente. Luego, evapore el contenido del tubo por el flujo de nitrógeno y almacene la muestra cubierta de nitrógeno a cuatro grados centígrados como se ha demostrado. Para analizar las muestras de TLC, cubra una pared de la cámara TLC con un trozo de papel de filtro, agregue vaselina en las esquinas de la cámara para sellar la cámara, para entablar la mezcla de solvente sobre el papel de filtro y agregar el volumen restante del solvente a la parte inferior de la cámara TLC.
Cierre la cámara TLC durante al menos 20 minutos para que se sature. Mientras tanto, disuelva los lípidos en el tubo de vidrio en 200 a 1000 microlitros de cloroformo y use un tubo de vidrio capilar para aplicar 10 microlitros de la suspensión de cloroformo lipídico directamente sobre la placa TLC. Después de dejar que la muestra se seque durante cinco minutos, inserte la placa en la cámara TLC saturada y permita que la fase móvil pase a través del TLC.
Cuando el disolvente alcance un centímetro del extremo superior de la placa, coloque la placa debajo del flujo laminar hasta que la sílice esté completamente seca. Luego, rocíe la placa seca con 15 a 20 mililitros de hidrato de ácido fosfórico de datos molares al 10% en etanol hasta que la placa esté de color amarillo brillante, y caliente la placa durante dos a cinco minutos a 120 grados centígrados. En este análisis representativo, el ácido micólico extraído de diversas especies de micobacterias, se analizó a través de TLC unidimensional utilizando dos sistemas de elución diferentes y TLC bidimensional.
También se realizaron dos tipos de procedimientos de metilación para confirmar la presencia de ácido micólico tipo cinco. En ambos sistemas de elución, los ácidos micólicos se localizaron aproximadamente en el centro de la placa, aunque, la mancha correspondiente al ácido micólico tipo cinco, se observó solo después de la saponificación. El TLC bidimensional también permite la identificación de tipos individuales de ácido micólico.
Por ejemplo, mycobacterium brumae expresa solo ácidos micólicos tipo uno, mycobacterium bovis BCG expresa tipos uno y cuatro, mycobacterium fortuitum expresa tipos uno y cinco, y mycobacterium abcessus expresa perfiles de ácido micólico tipo uno y dos. Los extractos lipídicos totales de varias especies de micobacterias se analizaron en función de su polaridad y tamaño. Revela que la mayoría de los lípidos polares A, como los PDIM, están presentes en mycobacterium bovis BCG, pero no en mycobacterium fortuitum, mycobacterium brumae y el morfotipo liso de M abcessus.
Los glicolípidos fenólicos están presentes solo en mycobacterium bovis BCG, mientras que los lipídidos de GlycoPeptido se observan solo en muestras de mycobacterium abcessus. Al igual que los ácidos micólicos, los acilgliceroles y PDIMs, PIMs, también se pueden visualizar fácilmente a través del análisis unidimensional TLC o 2D TLC. Se utilizaron dos tipos de manchas para revelar PIMs en TLC unidimensional.
Lo más importante que debe recordar al intentar este protocolo es no usar ningún instrumento de plástico durante todo el procedimiento.
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