Biology
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通过受激拉曼散射成像对氘掺入单个细菌进行快速抗菌药敏试验
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Summary February 14th, 2022
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该协议通过D 2 O代谢的单细胞刺激拉曼散射成像在2.5小时内提供快速抗菌药敏试验（AST）测定。该方法适用于尿液或全血环境中的细菌，对于临床上的快速单细胞表型AST具有变革性。
Transcript
可以在2.5小时内在尿液和血液中进行快速抗菌药敏试验，与传统的肉汤微量稀释方法相比，这被认为大大缩短了分析时间。它可以在复杂环境中监测细菌代谢活动，例如全血。首先，通过使用600纳米波长的光度计测量光密度来检查样品中的细菌浓度。
为了达到每毫升第五个菌落形成单位（CFU）的8倍10的最终细胞浓度，请使用不含氘的正常MHB培养基稀释细菌溶液。通过涡旋混合细菌细胞后，在一个1.5毫升微管中除去300微升等分试样的细菌溶液，在一个1.5毫升微管中取出600微升等分试样的细菌溶液。然后将4.8微升抗生素储备溶液加入含有600微升细菌溶液的微管中，以达到每毫升8微克的最终抗生素浓度。
将300微升含抗生素的细菌溶液加入不含抗生素的300微升等分试样中，以获得两倍稀释溶液，最终抗生素浓度为每毫升4微克。重复测试抗生素的两倍连续稀释，直到达到每毫升0.25微克的最低浓度。从最后一个微管中丢弃300微升溶液。
将一根不含抗生素的试管分配给使用氘处理的阳性对照，将无氘的阴性对照分配。将细菌等分试样与含有MHB的抗生素培养基孵育一小时。同时，用100%含氘的MHB培养基制备抗生素的系列稀释液，浓度梯度与前面描述的相同。
孵育一小时后，将700微升用100%含氘MHB培养基连续稀释的抗生素加入相同抗生素浓度的300微升抗生素预处理细菌中。通过上下移液几次使混合物均质化。将 700 微升不含抗生素的 100% 含 MHB 培养基加入 300 微升无抗生素细菌作为阳性对照。
将 700 微升不含抗生素的 0% 氘含有 MHB 培养基加入 300 微升无抗生素细菌作为阴性对照。将所有微管在 37 摄氏度下孵育，每分钟 200 转 30 分钟。孵育后，将一毫升抗生素和氘处理过的细菌样品在6， 200倍g下在4摄氏度下离心5分钟。
然后用纯净水清洗沉淀两次。将样品固定在10%体积的福尔马林溶液中，并将其储存在4摄氏度。通过使用600纳米波长的光度计测量光密度，检查新鲜制备的细菌样品中的大肠杆菌浓度。
为了模拟临床尿路感染样本，将大肠杆菌样本加标到 10 毫升去识别的尿液样本中，以达到每毫升 10 至 6 CFU 的最终浓度。使用五微米过滤器过滤大肠杆菌加标尿液，并将过滤后的细菌溶液以300微升等分试样分成七个1.5毫升微管，将600微升等分试样分成一个1.5毫升微管。如前所述，在抗生素存在下进行氘掺入处理。
为了模拟临床血流感染样本，在一毫升去识别化的人类血液中加入铜绿假单胞菌，以达到每毫升 10 至 6 CFU 的最终浓度。要裂解血液，请加入九毫升无菌纯净水。使用五微米过滤器过滤铜绿假单胞菌加标的血液。
然后，通过在4摄氏度下以6， 200倍g离心5分钟，从过滤后的样品中收获细菌至1毫升体积。离心后，将300微升等分试样中的铜绿假单胞菌加标血液溶液分成七个1.5毫升微管和1个1.5毫升微管中的600微升等分试样细菌溶液，并在抗生素存在下进行氘掺入处理如前所述。样品制备时，用纯净水洗涤1毫升固定细菌溶液，并将洗涤后的细菌溶液以6， 200倍g离心5分钟，温度为4摄氏度。
除去上清液，用灭菌水将细菌溶液富集至约20微升。将细菌溶液沉积在聚-L-赖氨酸涂层盖玻片上，与另一个盖玻片夹心，并密封样品。在SRS显微镜中，具有80兆赫兹重复率的可调飞秒激光器提供泵浦和斯托克斯激发激光器。
斯托克斯光束由2.4兆赫兹的声光调制器调制。两束光束通过二向色镜组合在一起。然后将泵浦和斯托克斯光束引导到实验室制造的激光扫描显微镜中，该显微镜带有2D振镜进行激光扫描。
60倍水镜将激光聚焦到样品上，油冷凝器从样品中收集信号。两个滤光片用于滤除斯托克斯光束，而泵浦光束由光电二极管检测，然后由锁相放大器提取受激拉曼信号。使用控制软件，输入泵浦波长并将其调谐为 852 纳米。
将C到D振动频率调整为2，168波数，以使用SRS显微镜对细菌进行成像。使用功率计测量激光功率。通过调整激光输出前面的半波板，将样品处的泵浦激光器功率设置为 8 毫瓦，将斯托克斯激光在样品处的功率设置为 50 毫瓦。
将标准样品DMSO d6放在样品台上，并使用60倍水浸物镜将泵浦和斯托克斯激光器聚焦在样品上。通过调整反射镜的螺钉，在空间上对齐泵浦和斯托克斯光束，并将两个光束引导到配备2D Galvo反射镜系统的正置显微镜中进行激光扫描。在软件控制面板中，将每个 SRS 图像设置为包含 200 x 200 像素，并将像素停留时间设置为 30 微秒。
一幅图像的总采集时间约为1.2秒。将步长设置为 150 纳米，因此图像大小约为 30 x 30 平方微米。优化系统后，取出标准样品，将细菌样品放在60倍水浸物镜下的样品台上。
开始细菌样本的SRS成像。为每个样本至少成像三个视野。孵育时间对氘掺入的影响通过CD和CH区域的自发拉曼显微光谱法测量。
单个细菌的氘孵育时间的 CD 与 CH 强度比图显示，在孵育时间内，CD 与 CH 强度的关系从 0 增加到 180 分钟。铜绿假单胞菌的SRS成像在与庆大霉素和70%氘孵育时进行。进一步的定量统计分析表明，与没有庆大霉素治疗相比，细菌的CD信号在每毫升2微克或庆大霉素浓度时显着降低。
临界强度阈值为0.60，得出的结论是，铜绿假单胞菌在每毫升2微克和更高浓度的庆大霉素下受到代谢抑制。在正常MHB培养基中，铜绿假单胞菌对庆大霉素的SC-MIC被确定为每毫升2微克，这在通过肉汤微量稀释法测定的MIC为每毫升4微克的一倍差异范围内。通过SRS成像对大肠杆菌加标尿液样本进行快速抗菌药敏试验（AST）。
测定大肠杆菌加标尿液样品阿莫西林的SC-MIC为每毫升4微克，其敏感性读数与常规肉汤稀释法测定正常MHB培养基中纯大肠杆菌的MIC为每毫升8微克相同。通过SRS成像研究了加标人血铜绿假单胞菌快速AST的适用性。SRS图像的CD强度为每厘米2，168，主要由来自活细菌代谢氘掺入的细菌信号主导。
血液中铜绿假单胞菌的SC-MIC为每毫升2微克，与正常生长培养基中铜绿假单胞菌的常规标准MIC结果吻合较好。根据临床和实验室标准协会的建议，用于抗菌药敏试验的细菌细胞数保持在每毫升10至第五个菌落形成单位的五倍左右。较高的细菌浓度会导致最小抑菌浓度的增加。
将原位病原体鉴定和快速抗微生物药物敏感性检测诊断相结合，可以转化为临床，以便及时识别适当的抗菌剂以进行精确治疗。
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