Tek Bir Bakteride Döteryum Birleşmesinin Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi ile Hızlı Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

Hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi, idrar ve kanda 2,5 saat içinde elde edilebilir, bu da geleneksel et suyu mikrodilüsyon yöntemine kıyasla analiz süresinde muazzam bir azalma olarak kabul edilir. Tam kan gibi karmaşık bir ortamda bakteriyel metabolik aktiviteyi izleyebilir. Başlamak için, optik yoğunluğu 600 nanometre dalga boyunda bir fotometre ile ölçerek numunelerden bakteri konsantrasyonunu kontrol edin.

Mililitre başına sekiz kez 10 ila beşinci Koloni Oluşturma Birimleri veya CFU’luk bir nihai hücre konsantrasyonuna ulaşmak için, döteryum içermeyen normal MHB ortamını kullanarak bakteriyel çözeltiyi seyreltin. Bakteri hücrelerini vorteks ile karıştırdıktan sonra, yedi adet 1.5 mililitrelik mikrotüp içinde bakteri çözeltisinin 300 mikrolitrelik alikotunu ve 1.5 mililitrelik bir mikrotüpte bakteriyel çözeltinin 600 mikrolitrelik alikotunu çıkarın. Daha sonra, mililitre başına sekiz mikrogramlık nihai antibiyotik konsantrasyonunu elde etmek için 600 mikrolitre bakteriyel çözelti içeren mikrotüpe 4.8 mikrolitre antibiyotik stok çözeltisi ekleyin.

Mililitre başına dört mikrogramlık son antibiyotik konsantrasyonu ile iki kat seyreltilmiş bir çözelti elde etmek için antibiyotiksiz bakteriyel çözeltinin 300 mikrolitrelik bir alikotuna antibiyotikli 300 mikrolitre bakteri çözeltisi ekleyin. Test antibiyotiklerinin iki kat seri seyreltilmesini, mililitre başına 0.25 mikrogramlık en düşük konsantrasyona ulaşılana kadar tekrarlayın. Son mikrotüpten çözeltinin 300 mikrolitresini atın.

Antibiyotik içermeyen bir tüpü döteryum tedavisi ile pozitif kontrole, negatif kontrole döteryum olmadan tahsis edin. Bakteriyel aliquot’u MHB ortamı içeren antibiyotik ile bir saat boyunca inkübe edin. Bu arada, daha önce tarif edildiği gibi aynı konsantrasyon gradyanlarına sahip% 100 döteryum içeren MHB ortamı ile antibiyotiklerin seri seyreltilmesini hazırlayın.

Bir saatlik inkübasyondan sonra, aynı antibiyotik konsantrasyonunda 300 mikrolitre antibiyotik önceden işlenmiş bakteriye% 100 döteryum içeren% 100 döteryum ile seri olarak seyreltilmiş 700 mikrolitre antibiyotik ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karışımı homojenize edin. Pozitif kontrol olarak MHB ortamı içeren 700 mikrolitre antibiyotiksiz% 100 döteryum ila 300 mikrolitre antibiyotik içermeyen bakteri ekleyin.

Negatif kontrol olarak MHB ortamı içeren 700 mikrolitre antibiyotiksiz% 0 döteryum ila 300 mikrolitre antibiyotik içermeyen bakteri ekleyin. Tüm mikrotüpleri 37 santigrat derecede ve 30 dakika boyunca dakikada 200 rotasyonda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bir mililitre antibiyotik ve döteryum ile muamele edilmiş bakteri örneğini dört santigrat derecede beş dakika boyunca 6.200 kez g’de santrifüj edin.

Daha sonra peleti arıtılmış suyla iki kez yıkayın. Numuneleri hacimce %10’luk bir hacimde sabitleyin ve formalin çözeltisini dört santigrat derecede saklayın. Optik yoğunluğu 600 nanometre dalga boyunda bir fotometre ile ölçerek taze hazırlanmış bakteri örneğinden Escherichia coli konsantrasyonunu kontrol edin.

Klinik idrar yolu enfeksiyonu örneklerini taklit etmek için, Escherichia coli örneğini 10 mililitre tanımlanmamış idrar örneğine yükseltin ve mililitre başına 10 ila altı CFU’luk bir nihai konsantrasyona ulaşın. Escherichia coli çivili idrarını beş mikronluk bir filtre kullanarak filtreleyin ve filtrelenmiş bakteri çözeltisini 300 mikrolitrelik alikotlarda yedi adet 1.5 mililitrelik mikrotüpe ve 600 mikrolitrelik bir alikotu 1.5 mililitrelik bir mikrotüpte bölün. Daha önce tarif edildiği gibi antibiyotik varlığında döteryum birleştirme tedavisi gerçekleştirin.

Klinik kan dolaşımı enfeksiyonu örneklerini taklit etmek için, mililitre başına 10 ila altıncı CFU’luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için bir mililitre tanımlanmamış insan kanındaki Pseudomonas aeruginosa’yı yükseltin. Kanı lize etmek için dokuz mililitre steril arıtılmış su ekleyin. Pseudomonas aeruginosa çivili kanını beş mikronluk bir filtre kullanarak filtreleyin.

Daha sonra, filtrelenmiş numuneden bakterileri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 6.200 kez g’de santrifüjleme yoluyla bir mililitrelik bir hacme kadar hasat edin. Santrifüjlemeden sonra, Pseudomonas aeruginosa çivili kan çözeltisini 300 mikrolitrelik alikotta yedi adet 1.5 mililitrelik mikrotüpe ve 1.5 mililitrelik bir mikrotüpte bakteriyel çözeltinin 600 mikrolitrelik alikotuna bölün ve daha önce tarif edildiği gibi antibiyotiklerin varlığında döteryum birleştirme tedavisi gerçekleştirin. Numune hazırlama için, bir mililitre sabit bakteri çözeltisini arıtılmış suyla yıkayın ve yıkanmış bakteri çözeltisini dört santigrat derecede beş dakika boyunca 6.200 kez g’de santrifüj edin.

Süpernatantı çıkarın ve bakteriyel çözeltiyi sterilize edilmiş suyla yaklaşık 20 mikrolitreye zenginleştirin. Bakteriyel çözeltiyi poli-L-lizin kaplı bir kapak camı üzerine koyun, başka bir kapak camı ile sandviç yapın ve numuneyi kapatın. SRS mikroskobunda, 80 megahertz tekrarlama hızına sahip ayarlanabilir bir femtosaniye lazer, pompayı ve Stokes uyarma lazerlerini sağlar.

Stokes ışını 2.4 megahertz’de bir akusto-optik modülatör tarafından modüle edilir. İki ışın, dikroik bir ayna aracılığıyla kolineredeyse birleştirilir. Daha sonra pompa ve Stokes ışınları, lazer tarama için 2D Galvo aynalı laboratuvar yapımı bir lazer tarama mikroskobuna yönlendirilir.

60x su hedefi, lazerleri numuneye odaklar ve bir yağ kondenseri numuneden gelen sinyali toplar. Stokes ışınını filtrelemek için iki filtre kullanılırken, pompa ışını bir fotodiyot tarafından algılanır, daha sonra uyarılan Raman sinyali bir kilitleme amplifikatörü tarafından çıkarılır. Kontrol yazılımını kullanarak, pompa dalga boyunu 852 nanometreye girin ve ayarlayın.

SRS mikroskobu kullanarak bakterileri görüntülemek için C’den D’ye titreşim frekansını 2.168 dalga numarasına ayarlayın. Bir güç ölçer kullanarak lazer gücünü ölçün. Lazer çıkışının önündeki yarım dalga plakasını ayarlayarak numunedeki pompa lazerinin gücünü sekiz miliwatt’a ve numunedeki Stokes lazerinin gücünü 50 miliwatt’a ayarlayın.

Standart DMSO d6 numunesini numune aşamasına yerleştirin ve pompayı ve Stokes lazerlerini numuneye odaklamak için 60x suya daldırma hedefi kullanın. Yansıma aynalarının vidalarını ayarlayarak, pompayı ve Stokes ışınlarını uzamsal olarak hizalayın ve iki ışını lazer tarama için 2D Galvo ayna sistemi ile donatılmış dik bir mikroskopa yönlendirin. Yazılım kontrol panelinde, her SRS görüntüsünü 200 x 200 piksel içerecek ve piksel bekleme süresini 30 mikrosaniye olarak ayarlayın.

Bir görüntü için toplam elde etme süresi yaklaşık 1,2 saniyedir. Adım boyutunu 150 nanometre olarak ayarlayın, böylece görüntü boyutu yaklaşık 30 x 30 mikrometre karedir. Sistemi optimize ettikten sonra, standart numuneyi çıkarın ve bakteri numunesini 60x suya daldırma hedefi altında numune aşamasına koyun.

Bakteri örneklerinin SRS görüntülemesini başlatın. Her örnek için en az üç görüş alanı görüntüleyin. Kuluçka süresinin döteryum kaynaşması üzerindeki etkisi, CD ve CH bölgelerinde spontan Raman mikrospektroskopisi ile ölçülür.

Tek bakteriler için döteryum inkübasyon süresi üzerindeki CD over CH yoğunluk oranı grafiği, inkübasyon süresi boyunca CH yoğunluğu üzerinde CD’nin sıfırdan 180 dakikaya yükseldiğini göstermiştir. Pseudomonas aeruginosa’nın SRS görüntülemesi gentamisin ve %70 döteryum ile inkübasyon üzerine yapıldı. Daha ileri nicel istatistiksel analiz, bakterilerin CD sinyallerinin mililitre başına iki mikrogramda veya gentamisin tedavisi olmadan daha yüksek gentamisin konsantrasyonunda önemli ölçüde daha düşük olduğunu göstermiştir.

0.60’taki kesme yoğunluğu eşiği, Pseudomonas aeruginosa’nın mililitre başına iki mikrogram ve daha yüksek gentamisin konsantrasyonlarında metabolik olarak inhibe edildiği sonucuna varmıştır. Normal bir MHB ortamında gentamisine karşı Pseudomonas aeruginosa için SC-MIC’nin, et suyu mikrodilüsyon yöntemi ile belirlenen mililitre başına dört mikrogramlık MIC ile mililitre başına dört mikrogram ile bir kat fark aralığında olan mililitre başına iki mikrogram olduğu belirlenmiştir. Escherichia coli çivili idrar örneklerinin Hızlı Antimikrobiyal Duyarlılık Testi veya AST, SRS görüntüleme ile gerçekleştirildi.

Amoksisilin’e karşı Escherichia coli çivili idrar örneği için SC-MIC’nin, normal MHB ortamında saf Escherichia coli için geleneksel et suyu seyreltme yöntemi ile mililitre başına sekiz mikrogramlık MIC ile aynı duyarlılık okumasına sahip olan mililitre başına dört mikrogram olduğu belirlenmiştir. İnsan kanında çivilenmiş Pseudomonas aeruginosa’nın hızlı AST’sinin uygulanabilirliği SRS görüntüleme ile araştırıldı. SRS görüntüsünün santimetre başına 2.168’deki CD yoğunluğuna, canlı bakterilerin metabolik döteryum katılımından kaynaklanan bakteri sinyalleri hakimdi.

Kandaki Pseudomonas aeruginosa için SC-MIC’nin mililitre başına iki mikrogram olduğu belirlendi ve bu da normal büyüme ortamındaki Pseudomonas aeruginosa için geleneksel standart MIC sonucuyla iyi bir şekilde uyuştu. Antimikrobiyal duyarlılık testi için kullanılan bakteriyel hücre sayısı, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü tarafından önerildiği gibi, mililitre başına beşinci koloni oluşturan birimlere yaklaşık beş kat 10 ila 10 arasında tutulur. Daha yüksek bakteri konsantrasyonu, minimal inhibitör konsantrasyonunda bir artışa neden olabilir.

İn situ patojen tanımlaması ve hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi tanısının birleştirilmesi, hassas tedavi için uygun antimikrobiyal ajanların zamanında tanımlanmasına izin veren bir kliniğe çeviri için büyük bir potansiyel olabilir.