Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolering av voksne menneskelige astrocyttpopulasjoner fra ferskfrossen cortex ved hjelp av fluorescensaktivert nuklei-sortering
Chapters
Summary April 16th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi har utviklet en metode som beriker og isolerer menneskelige astrocyttpopulasjoner fra ferskfrosset vev til bruk i nedstrøms molekylære analyser.
Transcript
Denne protokollen kan hjelpe forskere som er interessert i å studere molekylær funksjon av menneskelige astrocytter i sin opprinnelige nisje. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater isolering og berikelse av en bestemt celletype, voksne astrocytter fra bulk menneskelige hjernevevsprøver ved hjelp av fluorescensaktivert kjernesortering. Denne metoden kan brukes til å isolere andre celletyper fra den menneskelige neocortex, som nevroner og oligodendrocytt stamceller ved hjelp av andre passende fluorescerende-konjugede antistoffer.
Begynn å dissekere ca 200 til 400 milligram vev fra en fersk frossen human voksen cortex vevsprøve. Legg vevet i en syv milliliter glassvevsduncer som inneholder fire milliliter iskald lysisbuffer på is og slip vevet ca. 50 ganger. Overfør homogenatet til et 12 milliliter ultracentrifuge polypropylenrør.
Bruk en pipette på fem milliliter til å tilsette 6,5 milliliter iskald sukrosebuffer til bunnen av ultracentrifugerøret uten å forstyrre grensesnittet mellom sukrose og vevshomogenat. For å samle kjernene, ultracentrifuge lysate i en time på 101, 814 ganger G og forsiktig aspirere supernatant og rusk uten å forstyrre pellet. Tilsett 0,1 % BSA i PBS i ultracentrifuge-røret for en 10-minutters inkubasjon på is før du bruker nuklei-pelletsen på nytt.
Bruk deretter trypan blå for å visualisere de intakte kjernene under et lysmikroskop og for å sikre at konsentrasjonen er over 10 til den femte kjernen per milliliter For fluorescensaktivert sortering av de isolerte kjernene, tilsett omtrent 20 mikroliter av den resuspenderte prøven til en antistoffløsning som inneholder Alexa fluor 555 konjugert mus anti-NeuN antistoff. Tilsett ca. 20 mikroliter av den resuspenderte prøven til en antistoffløsning som inneholder APC-konjugert mus anti-PAX6 antistoff. Etter en times inkubasjon ved fire grader Celsius med risting, beskyttet mot lys, legg til DAPI med et 1:1000-forhold til alle prøvene og kontrollene.
For å inkludere kjerner av riktig størrelse og for å utelukke røde blodlegemer og rusk, bruk et kontrollrør for å portere cellene ved deres fremover- og sidespredningsområder. Hvis du vil merke kjernepopulasjonen med én kjerner, kan du gate by forward scatter-området kontra fremover punktbredde eller høyde og sidespredningsområde kontra sidespredningsbredde eller -høyde. Gate by DAPI å inkludere bare intakte nuclei singlets og å utelukke eventuelle rusk og dobler.
Etter å ha kneblet i henhold til eventuelle ekstra fluorescenskontroller, kjør dapi-bare kontrollprøven. Kjør NeuN Alexa fluor 555-only-kontrollen for å bestemme avskjæringen for NeuN-positiv farging i Alexa fluor 555-kanalen. Kjør pax6 APC-kontrollen for å fastslå avskjæringen for PAX6-positiv farging i APC-kanalen.
Etter at alle kontrollene er kjørt, gate de NeuN-positive cellene for å samle nevronene og gate PAX6-positive celler med NeuN-negativ populasjonen for å samle astrocytter. Gate og samle eventuelle ekstra glial populasjoner av interesse fra NeuN-negativ PAX6-negativ befolkning. For bulk enkeltkjerne RNA-sekvensering, etter å ha samlet 50.000 til 500.000 kjernekjerner i 0,04% BSA-supplert PBS, tilsett to milliliter sukroseoppløsning, 50 mikroliter av en-molar kalsiumklorid og 30 mikroliter av en-molar magnesiumacetat til prøven.
Ta med det endelige volumet av suspensjonen opp til 10 milliliter med PBS. Bland rørinnholdet ved inversjon og inkuber reaksjonen på is i 15 minutter. Pellet kjernen ved sentrifugering og resuspend kjernen i en milliliter av RNA ekstraherende reagens.
Deretter vortex røret, fryse prøven på tørris, og lagre kjernen på minus 80 grader Celsius. For bulk single-nucleus transposase-akseptabel kromatin sekvensering, samle 50,000 til 75, 000 kjerner i 0,04%BSA-supplert PBS i et mikrocentrifuge rør belagt med 5%BSA og fryse kjernen til nedstrøms analyse. Neuronale, astrocytt og oligodendrocytt stamcellepopulasjoner kan sorteres fra en fersk frossen postmortem menneskelig temporal neocortex prøve som demonstrert.
Single-nucleus RNA sekvensering studier ytterligere prioritert PAX6 som en topp differensialt uttrykt kjernefysisk transkripsjon faktor på tvers av både protoplasmatiske og fibrøse voksne astrocytter subpopulations. Etter sortering kan celletypespesifikke transkripsjonsendringer i den primære patologiske epilepsi neocortex karakteriseres. I denne analysen bekreftet transkripsjonsanalyser at de PAX6-positive NeuN-negative populasjonene var robust beriket for panastrocyttmarkører og utarmet for nevronmarkører.
Immunfluorescensfarging kan brukes til å bekrefte samlokalisering av PAX6 med glial fibrillært surt protein i humane kortikale astrocytter. Kortere postmortem intervaller er forbundet med en større intakt nuclei utvinning fra friske vev prøver. Et høyt utbytte av intakte kjerner kan gjenopprettes fra frossent vev opptil 24 timer ettermortem, men på 30 timer kan svært få intakte kjerner gjenopprettes.
Det viktigste å huske er å få DEN PAX6-positive befolkningen fra den NeuN-negative befolkningen, fordi det er nevroner som også uttrykker PAX6, og vi ønsker å ekskludere dem. Denne teknikken tillot også studiet av astrocytter i epilepsi kirurgiske hjerneprøver, og ytterligere belyse molekylær dysregulering av menneskelige astrocytter i sammenheng med en bestemt patologisk nisje.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
