Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Erkek Aedes aegypti Sivrisineklerinde Çiftleşme Rekabet Gücünü Incelemek için Floresan Boyası Rhodamine B'yi Kullanmak
Chapters
Summary May 7th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Burada, erkek Aedes aegypti'nin çiftleşme rekabet gücünün bir işaretleyici olarak floresan boyası kullanılarak incelenmesi için bir protokol sunuyoruz. Dişi sivrisinekler çiftleşme için hem işaretli hem de işaretlenmemiş erkeklere maruz kalır. Çiftleşme sonrası spermathecae'leri çiftleşme partnerlerini belirlemek için floresan mikroskop altında incelenir.
Transcript
Bu protokol, erkek salınımlı sivrisinek popülasyonu bastırma programları için bir ön koşul olan erkek sivrisinek çiftleşme rekabet gücünü ölçer. Bu fitness kriteri kalite kontrol ve gerinim değerlendirmesinin bir parçası olarak değerlendirilir. Bu yöntem deneysel süreyi% 90 azaltır ve iki steril veya Wolbachia enfekte hat arasında çiftleşme rekabet gücünün doğrudan karşılaştırılmasına izin verir.
Bu işlemi Irene Li ve Keng Wai Mak yapacaktır. Başlamak için, erkek ve dişi sivrisinekleri boyut farklılıklarına göre pupal aşamasında cinsiyete bağlayın. Her sivrisinek seti için, 100 erkek pupayı sakkaroz besleme veya Rhodamine B sakkaroz besleme için önceden etiketlenmiş bir kafese aktarın.
Dişi pupaları kafes başına 40 ila 50 arasında küçük gruplar halinde yerleştirin. Imagos'un ortaya çıkmasından sonra, kafesleri erkek sivrisineklerin varlığı için kontrol edin. % 0.2 Rhodamine B sakkaroz çözeltisini hazırlamak için, her 100 mililitre% 10 sakkaroz çözeltisi için 200 miligram Rhodamine B tozunun çözün.
Tüm tozun çözüldüğüne emin olmak için iyice karıştırın. Fitil ile 20 şeker besleyici şişe hazırlayın. 10 besleyici şişeye 10 mililitre% 10 sakkaroz ve diğer 10 besleyici şişe için 10 mililitre% 0.2 Rhodamine B sakkaroz çözeltisi ekleyin.
Hazırlanan her erkek kafesine beş besleyici şişe yerleştirin ve erkek sivrisineklerin çiftleşme deneyinden önce üç gün boyunca beslenmesine izin verin. Cıva yakıcı lambayı ve stereo mikroskobu açın. Cıva brülörü lambasına giden ışık kaynağının 10 dakika boyunca stabilize olmasını bekleyin.
Daha sonra kırmızı floresan proteini bir için floresan filtrelerini ayarlayın. Oral aspiratör cam tüpüne bir seferde az sayıda sivrisinek aspire edin. Cam tüpten, floresan stereo mikroskop altında erkek sivrisineklerin vücudunu gözlemleyin.
Deney için sadece Rhodamine B ile işaretlenmiş erkek sivrisinekleri kullanın. Transfer seti Ağ ile sabitlenerek 12 kağıt bardak içine bir erkek sivrisinek. Bardak başına 10 sakkarozla beslenen erkek sivrisinekleri altı bardağa yerleştirin ve diğer altı bardağa fincan başına 10 Rhodamine B sakkaroz beslendi.
B kümesi erkek sivrisinekler için bu adımı tekrarlayın. Çiftleşme tahlilleri için 12 kafes kurun. Altı kafesin her birinde, Rhodamine B işaretli 10 set A erkek sivrisinek, 10 işaretsiz B kümesi erkek sivrisinek ve 10 bakir vahşi tip dişi sivrisinek bulunur.
Diğer altı kafeste, 10 işaretsiz set A erkek sivrisinek, 10 Rhodamine B işaretli B seti erkek sivrisinek ve 10 bakir vahşi tip dişi sivrisinek bulunur. İki çiftleşme kombinasyonunu net bir şekilde ayırt etmek için bu kafesleri etiketle. İlgili erkek bardaklarını etiketlere göre çiftleşme kafeslerine yerleştirin.
Ağı çıkarın ve erkekleri fincandan çıkarmak için yavaşça bardağa dokunun. Hiçbir sivrisineğin kafesten kaçmamasını sağlamak için kağıt bardağı ve ağı dikkatlice kafesten çıkarın. Erkek sivrisineklerin çiftleşme kafesine en az bir saat alışmasına izin verin.
Oral bir aspiratör kullanarak, bakire vahşi tip dişi sivrisinekleri, her bardak 10 sivrisinek içeren 12 kağıt bardağa aktarın. Erkek sivrisinekler için alışma döneminden sonra, her çiftleşme kafesine bir bardak dişi aktarın ve ağı çıkarın. Kalan dişi sivrisinekleri fincandan teşvik etmek için fincanı hafifçe itin, ardından hiçbir sivrisineklerin kafesten kaçmamasını sağlamak için kağıt bardağı ve ağı dikkatlice kafesten çıkarın.
Çiftleşmenin üç saat boyunca gerçekleşmesine izin verin ve ardından mekanik bir aspiratör ile her kafesten tüm sivrisinekleri çıkararak çiftleşme deneyini sonlandırın. Sivrisinekleri buz üzerinde en az beş dakika soğuk uyuşturun. Sivrisinekler tamamen uyuşturulduğu zaman, dişi sivrisinekleri hafifçe toplayın ve ağ ile sabitlenmiş ayrı bir kağıt bardağa barındırın.
Kağıt kabı, ilgili etiketi çiftleşme kafesinden bardağa aktararak etiketleyin. Dişi spermathecae puanlamak için, bir stereo mikroskop altında diseksiyondan önce en az beş dakika boyunca buz üzerinde dişi sivrisinekleri soğuk uyuşturun. Dişi sivrisinekleri stereo mikroskop altında parçalara ayrıştırın.
Spermathecae'yi mikroskop altında inceleyin. Dişi döllenmezse, üç spermathecae de boş olur ve döllenirse spermathecae'nin iki veya üçü hareketli spermle doldurulur. Döllenmiş bireyler için, spermathecae'nin Rhodamine B işaretli seminal sıvı içerip içermediğini, RFP1 filtresi ile donatılmış floresan stereo mikroskop altında inceleyerek belirleyin.
Spermathecae, Rhodamine B ile işaretlenmemiş seminal sıvı ile doldurulursa, floresan gözlenmez. Öte yandan, spermatheca Rhodamine B işaretli seminal sıvı içeriyorsa, floresan turuncu olurdu. Bu çiftleşme rekabet tahlilinin amacı, birkaç nesil akraba evliliğinden sonra erkek çiftleşme zindeliğinde bir kayıp olup olmadığını belirlemekti.
Çiftleşme rekabet gücü testinin deneysel triplicates yapıldı ve tohumlama verileri burada gösterilmiştir. Yabani tip dişiler, karşılıklı işaretle, doğuştan veya outcross erkekler tarafından döllendi. Sonuçlar, doğuştan veya dıştan doğmuş erkekler tarafından döllenen kadınların oranının Rhodamine B işaretinden etkilenmediğini göstermektedir.
Kadınların önemli ölçüde daha yüksek bir yüzdesi, her üç kopyadaki doğuştan gelen erkeklere göre outcross erkeklerle çiftleşti, bu da akraba evliliğinin çiftleşme zindeliğinde kayba yol açabileceğini gösteriyor. Dişi sivrisineklerin ekstra kafeslerini hazırlamak önemlidir. Önceden döllenmiş dişiler tüm verileri geçersiz kılacağından, erkek sivrisinekler tarafından kontamine olmuş bir kafesten dişi sivrisinekler kullanmayın.
Laboratuvar tabanlı çiftleşme rekabet gücü tahlilleri dışında, bu prosedür böcek çiftleşme biyolojisini, popülasyon dinamiklerini ve dağılımını incelemek için mark release-recapture deneylerinde kullanılabilir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
