Vaststelling en genetische manipulatie van Murine Hepatocyte Organoïden

De lever is het grootste orgaan bij zoogdieren. Het speelt een zeer belangrijke rol in het metabolisme en ontgifting. Hoewel de lever in vitro een opmerkelijke regeneratiecapaciteit heeft, is het nog steeds een zeer grote uitdaging voor een lange termijn om hepatocyten in vitro te kweken.

Hier stellen we de hepatocyten organoïden vast van volwassen hepatocyten. Het behoudt de belangrijkste kenmerken van hepatocyten in morfologie en functie. In deze video zullen we introduceren hoe we deze organoïden kunnen kweken en passeren en hoe we de genetische modificatie van deze organoïden in detail kunnen uitvoeren.

Ten eerste, leverperfusie en spijsvertering. Bereid alle regio’s en de instrumenten voor en maak ze steriel. Was de muis en open het epidermale en de huid en probeer vervolgens de buideloven van de lever te vinden.

Injecteer de naalden erin en vang dit vervolgens op. Doe de perfusie met een snelheid van vijf milliliter per minuut, totdat de lever bleek wordt. Verander ze in de perfusiebuffer, plaats ze zorgvuldig, let op de lever, totdat deze zacht wordt.

Meestal duurt het drie tot vijf minuten, knip dan de lever en doe ze in de platen en knip ze in kleine stukjes met de schaar. Pep het regelmatig op en neer. Meestal duurt het 10 tot 15 minuten om ze in de enkele cel te maken.

En pep het dan op en neer met 10 tot 15 minuten en voer ze door de monteur. Maak er enkele cellen van. Verzamel alle cellen in de buis van 50 milliliter en centrifugeer ze met de snelheid en verzamel vervolgens alle per platen.

Probeer ze altijd in het koude ijs te houden. Maak de eencellige suspensies en tel ze met de celteller. Meestal de hepatocyten als ze gelukkig zijn, heeft het de levendige fluorescerende.

Het tweede deel proberen we de cellen te plaatsen en de organoïde cultuur te doen. We verzamelen alle cellen suspensies, en tellen de cellen met een bepaalde concentro-fusie En dan mengen we de. Metrogels. en het codemedium.

Meestal nemen we, met het medium en de metrogels, in de verhouding van 1 tot 2 of 1 tot 3. Nadat we ze zorgvuldig hebben gemengd, plaatsen we ze op de gradiëntplaten. We voegen meestal 100 microliter toe aan de 24 plaatput.

Doe ze in de couveuse bij een temperatuur van 37 graden. Na 20 minuten zetten we ze omgekeerd naar voren met de onderkant aan de onderkant en vervolgens aan het medium. Met twee of drie dagen tegen de rug zien we meestal de organoïden naar buiten komen.

Dit is het typische beeld van onze organoïden. We hebben meestal enkele cellen van organoïden nodig als we de passage willen doen of een genetische modificatiemethode willen doen We verzamelen alle organoïden van de tegenplaten met de wasbuffer. We laten het supernatant vallen, dan bij de wasbuffer in de plaat, mengen ze, dus pep het op en neer.

En dan wassen we meestal alle tips voor met de wastapes buffer. Om te voorkomen dat alle organoïden op de uiteinden tippen. En dan met de, een nieuwe partij op ijs of zonder, verzamelen we alle organoïden door centro-fusie.

We behandelen ze, er is een conning radients om alle metrogels te verwijderen. Na 20 tot 30 minuten incubatie op ijs worden alle metrogels verwijderd. We verzamelen alle schone organoïden en voegen trypsine toe om er enkele cellen van te maken.

Nadat trypsine is toegevoegd, behandelen we de organoïden in de incubator. Het duurt 5 tot 10 minuten voordat leverorganoïden enkele cellen worden. We voegen meer wasbuffers toe om het triplatijn te stoppen.

En dan op en neer naar hen toe. Voor het optieproces kunt u ze nog een keer wassen om alle trypsine te verwijderen. Na het wassen door centrofusie kunnen we ze onder de celteller tellen.

Vervolgens zullen we laten zien hoe we transactie of transfectie van deze hepatocytenorganoïden kunnen doen. Label eerst de buizen van wat u gaat doen en vervolgens doen we de transfectie van het gezichtsvermogen volgens de instructies van de fabrikant. Je hebt, de regent van lipoyl fact taming INI MaX.

We voegen de. controle en het specifieke gen siRNA, en incubateer ze met het optimum, volgens de instructies van de fabrikant. En dan voegen we volgens de celconcentratie de RAN max toe en mengen ze grondig.

Dan voegen we ook de RAN max met het optimum apart toe en zetten ze op ijs. Na 5 minuten pepten we een apart RAN max-mengsel op met verschillende siRNA’s, specifieke gen-RANi en II-controle afzonderlijk en mengen ze grondig. Zet ze weer op ijs, en dan verzamelen we alle organoïden, vertragen de centrofusie, laten al het supernatant vallen, we voegen de RNAi max, het siRNA-mengsel toe aan deze celplaat en pepen het grondig op en neer.

Kortom, de cellen en het label RNAi max en siRNA-mengsel waren gentrificatie en incuberen gedurende 4 tot 5 uur bij 37 graden. Laatste deel, deze hepatocyten organoïden kunnen ook worden geïnfecteerd door het Lenti-virus. De vergelijkbare boodschap werd uitgevoerd als siRNA-transfectie.

De controle en de siRNA-virusbuizen waren goed voorbereid, en het optimum werd toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant. Dan met de infectiegebieden zoals polygroen en dan voegen we verschillende Lenti-virus toe, volgens de instructies van de fabrikant. Combineer de eencellige suspensies in organoïdencultuur en verschillende deeltjes in de eppendorfbuizen van 1,5 milliliter, voeg toe, nou ja, meng ze Plaat dit mengsel en concentreer ze gedurende 1 uur op 32 graden.

De concentraatfusie zal worden uitgevoerd bij 500 G.En na 4 tot 5 uur incubatie bij 37 graden zal de celsuspensie dan worden verzameld en in metrogel worden gezeten. En zet ze weer in de couveuse. Het orgaan op de formatie-efficiëntie of andere functionele analyse kon 7 tot 10 dagen later worden uitgevoerd.

Hier zijn onze representatieve resultaten. In figuur 1A kon je onze ALB-Cre Rosa 26-GFP of RFP hepatocyten organoïde van muis zien. In figuur 1B kon je het Ki67 positieve signaal in kleuring zien, wat heeft aangetoond dat onze hepatocyten organoïden zich vermenigvuldigen.

In figuur 2A en 2B staat hier een representatieve genexpressie van onze storende expressie van onze genen. Na genetische manipulatie in hepatocytenorganoïden is het interfererende effect zeer efficiënt. Hier is figuur 2C, je zou kunnen zien na genetische manipulatie met carsoniettechnologie in onze muizenorganoïden.

Concluderend toonden onze resultaten aan dat de hepatocyten organoïden in vitro konden worden uitgebreid en genetisch gemanipuleerd. Samenvattend laten we in deze video zien hoe je de leverperfusie en spijsvertering kunt doen om de hepatocyten te krijgen. Hoe de hepatocyten te vangen en de hepatocytenorganoïden te passeren.

Ook lieten we zien hoe we de siRNA- en vectortransfectie of Lenti-virusinfectie konden doen om de modificatie van de genetica van deze organoïden te doen. Ook hebben we twee tekorten aan onze organoïden. Ten eerste gebruikten we niet per kern of bontkern om de hepatocyten te zuiveren.

En ten tweede denk ik dat er meer groeifactoren en signalering moeten worden geprobeerd om de groeitijd van de organoïden te verbeteren.