4,367 Views
•
14:54 min
•
February 12, 2022
DOI:
Leveren er det største organet i pattedyr. Det spiller svært viktig rolle i metabolisme og avgiftning. Selv om leveren har en bemerkelsesverdig regenereringskapasitet in vitro, er det fortsatt en veldig stor utfordring på lang sikt til kultur hepatocytt in-vitro.
Her etablerer vi hepatocytter organoider fra modne hepatocytter. Det holder hovedtrekk ved hepatocytter i morfologi og funksjon. I denne videoen vil vi introdusere hvordan du kan kultur og passere disse organoidene og hvordan du utfører den genetiske modifikasjonen av disse organoidene i detaljer.
For det første leverperfusjon og fordøyelse. Forbered alle regionene og instrumentene og gjør dem sterile. Vask musen og åpne epidermal og huden, og prøv deretter å finne posen ovnen i leveren.
Injiser nålene i den, og ta deretter dette. Gjør perfusjonen med en hastighet på fem milliliter per minutt, til leveren blir blek. Endre dem til perfusjonsbufferen, plasser forsiktig, se på leveren, til den blir myk.
Vanligvis tar det tre til fem minutter, Klipp deretter leveren og legg dem i platene, og kutt dem i små biter med saksen. Pep det opp og ned ofte. Vanligvis tar det 10 til 15 minutter å gjøre dem til enkeltcellen.
Og pep det opp og ned med 10 til 15 minutter og mate dem gjennom montøren. Gjør dem til enkeltcellene. Samle alle cellene i 50 milliliterrøret, og sentrifuger dem, med hastigheten og samle deretter alle per platene.
Prøv å holde dem alltid i den kalde isen. Lag enkeltcellesuspensjonene, og tell dem med celletelleren. Vanligvis hepatocyttene hvis de er glade, har den den livlige fluorescerende.
Den andre delen prøver vi å sitte cellene og gjøre organoidkulturen. Vi samler alle cellene suspensjoner, og teller cellene med en viss concentro-fusion Og så blander vi. Metrogeler. og kodemediet.
Vanligvis tar vi, med mediet og metrogelene, i forholdet 1 til 2 eller 1 til 3. Etter å ha blandet dem forsiktig, sitter vi dem på gradientplatene. Vi legger vanligvis til 100 mikroliter på 24-platebrønnen.
Sett dem inn i inkubatoren ved en temperatur på 37 grader. Etter 20 minutter legger vi dem bakover fremover med bunnen nederst og deretter på mediet. Med to eller tre dager motarbeid ser vi vanligvis organoidene komme ut.
Dette er det typiske bildet av organoidene våre. Vi trenger vanligvis enkeltceller fra organoider hvis vi vil gjøre passasjen eller gjøre noen genetisk modifikasjonsmetode Vi samler alle organoidene fra motplatene med frakkvaskbufferen. Vi slipper supernatanten, deretter ved frakkvaskbufferen inn i platen, bland dem, så pep det opp og ned.
Og så forhåndsvasker vi vanligvis alle tipsene med vaskebåndbufferen. For å unngå at alle organoidene tipper på spissene. Og så med, en ny batch på is eller uten den, samler vi alle organoidene ved centro-fusion.
Vi behandler dem, det er en conning radients å fjerne alle metrogels. Etter 20 til 30 minutter med inkubasjon på is fjernes alle metrogelene. Vi samler alle de rene organoidene og legger til trypsin for å gjøre dem til enkeltceller.
Etter at trypsin er tilsatt, behandler vi organoidene i inkubatoren. Det tar 5 til 10 minutter for leverorganoider å bli enkeltceller. Vi legger til flere vaskebuffere for å stoppe triplatin.
Og så pep det opp og ned mot dem. For alternativprosess kan du vaske dem en gang til for å fjerne alle trypsin. Etter vask ved sentrofusjon kan vi telle dem under celledisken.
Da vil vi vise hvordan du gjør transaksjon eller transfeksjon av disse hepatocytter organoider. Først merker du rørene til hva du skal gjøre, og så gjør vi synstransfeksjonen i henhold til produsentens instruksjoner. Du trenger, regenten av lipoyl faktum taming INI MaX.
Vi legger til. kontroll og det spesifikke genet siRNA, og inkuber dem med det optimale, i henhold til produsentens instruksjoner. Og så i henhold til cellekonsentrasjonen legger vi til RAN max og blander dem grundig.
Deretter legger vi også til RAN max med det optimale separat og legger dem på is. Etter 5 minutter pep opp separat RAN max blanding med forskjellige siRNAer, Spesifikk gen RANi og II kontroll separat og bland dem grundig. Sett dem på is igjen, og så samler vi alle organoidene, langsom sentrofusjon, slipper alle supernatanten, vi legger til RNAi max, siRNA-blandingen i denne celleplaten og pep den opp og ned grundig.
Kort sagt var cellene og etiketten RNAi max og siRNA-blanding gentrifisering og inkuberer i 4 til 5 timer ved 37 grader. Siste del, disse hepatocytter organoider kan også bli smittet av Lenti viruset. Den lignende meldingen ble utført som siRNA-transfeksjon.
Kontrollen og siRNA-virusrørene var godt forberedt, og det optimale ble lagt til i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter med infeksjonsregionene som polygrønn, og så legger vi til forskjellige Lenti-virus, i henhold til produsentens instruksjoner grunnlov. Kombiner enkeltcelle suspensjoner i organoider kultur og ulike partikler i 1,5 milliliter eppendorf rør, Legg til, vel, bland dem Plate denne blandingen, og konsentrer dem i 1 time ved 32 grader.
Konsentratfusjonen vil bli utført ved 500 G.Og etter 4 til 5 timers inkubasjon ved 37 grader vil cellefjæringen deretter bli samlet og sittende i metrogel. Og legg dem i inkubatoren igjen. Organet på formasjonseffektiviteten eller annen funksjonell analyse kan utføres 7 til 10 dager senere.
Her er våre representative resultater. I figur 1A kunne du se vår ALB-Cre Rosa 26-GFP eller RFP hepatocytter organoid fra musen. I figur 1B kunne du se Ki67 positivt signal i farging, som har vist at våre hepatocytter organoider sprer seg.
I figur 2A og 2B her er et representativt genuttrykk for vårt forstyrrende uttrykk for genene våre. Etter genetisk manipulasjon i hepatocytter organoider, er den forstyrrende effektive svært effektiv. Her er figur 2C, du kan se etter genetisk manipulasjon med carsonittteknologi i våre murine organoider.
Konklusjonen, våre resultater viste at hepatocytter organoider kunne utvides in vitro og genetisk manipulert. Oppsummert, i denne videoen viser vi hvordan du gjør leveren perfusjon og fordøyelse for å få hepatocytter. Hvordan fange hepatocyttene og passere hepatocytter organoider.
Vi viste også hvordan du gjør siRNA og vektortransfeksjon eller Lenti virusinfeksjon for å gjøre modifikasjonen av genetikken til disse organoidene. Vi har også to mangler i organoidene våre. For det første brukte vi ikke per kjerne eller pelskjerne for å rense hepatocyttene.
Og for det andre tror jeg flere vekstfaktorer og signalering bør prøves å forbedre organoidenes veksttid.
Et langsiktig ex vitro 3D organoid kultursystem ble etablert fra musen hepatocytter. Disse organoidene kan passeres og genetisk manipuleres ved lentivirusinfeksjon av shRNA / ektopisk konstruksjon, siRNA-transfeksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid.
Read Article
Cite this Article
Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids. J. Vis. Exp. (180), e62438, doi:10.3791/62438 (2022).
Copy